By Jayne Hesley, Evan Cromwell, Paula Rickert Gedraitis, Grischa Chandy, Michael Sjaastad, and Timothy Baranowski1 MDS Analytical Technologies (US) Inc., Sunnyvale, California Zygogen LLC, Atlanta, Georgia1 

摘要

大型生物体，如斑马鱼胚胎，已成为开发用于药物发现和毒理学研究的疾病相关检测的有吸引力的模型系统。执行这些检验的一个限制是要有快速图像采集系统，该系统要具有足够的分辨率和景深来准确表征此类生物体。第二个限制是对复杂图像的分析，以提供对测定中感兴趣的生物学特征的快速和准确的量化。此处，我们报告了 IsoCyte® 激光扫描成像仪用于三维目标的高通量图像采集，同时结合MetaXpress®和AcuityXpress®软件应用程序，用于可视化和数据分析。专有的光学系统具有大景深（400 μm），可以在不到5分钟的时间内为每个微孔板采集全孔图像。图像是在两个激光散射中同时获得的，它提供了物体的无标记图像，以及最多三个其他荧光通道（例如，绿色荧光蛋白标记的血管）。此处将介绍384 孔板格式的两个应用程序。在一个例子中，分析了用于鉴定影响血管生成血管的治疗剂的活 Z-Tag斑马鱼胚胎 (Zygogen)。在另一个例子中，测试了一组物质不同剂量对发育中的斑马鱼胚胎的急性毒性作用。结果表明，使用组合的数据采集和分析软件可以快速准确地对血管进行计数，并且可以快速测量对形态学的毒性影响。

简介

斑马鱼为测试化合物的效果提供了一个有吸引力的模型，因为它们结合了基于细胞的检测的通量和动物模型的生物学相关性。由于斑马鱼胚胎在头 5 天内发育出大部分主要器官系统，并且具有可渗透的、透明的皮肤很容易使感兴趣的特定组织可视化，尤其是在荧光报告蛋白的帮助下。本研究调查了1）血管生成抑制化合物（Vatalanib/PTK787）对在其脉管系统中表达绿礁珊瑚荧光蛋白的发育中的胚胎尾部血管形成的剂量依赖性影响；2）不同剂量已知毒性化合物处理24小时对斑马鱼胚胎的长度和形态的影响。为了在筛选场景中有效利用胚胎，将它们活着分配到384孔微孔板的孔中，加入药物，并在IsoCyte® DL激光扫描成像仪上进行扫描。同步获取的图像能显示荧光信号和激光散射（类似于明场）信号。生成的图像在采集过程中“即时”分析，或导入MetaXpress®软件进行分析。

材料和方法

Z-TagSM 血管生成试验入门试剂盒（Zygogen）Z-Tag荧光血管胚胎（Zygogen）

二甲基亚（Sigma, PN 276855）

乙醇（Sigma, PN 459836）

氯氮平（Sigma, PN C6305）

马拉息昂（Spectracide 50%）

六氯酚（Sigma PN 4-0323）

三聚氰胺（Beacon Analytical, PN 20-0158）

384孔玻璃底微孔板（Matrical, MGB1011-HG）

血管生成分析程序

在进行运输前，受精1天后的胚胎用Zygogen进行酶解脱氯，用不同剂量的Vatalanib/PTK787或1%二甲基亚砜进行处理。收到后，384孔透明底板每孔加入60uL溶液并置入一个胚胎。胚胎按照每个剂量5-8复孔按列排列。在孔板内平衡2小时后，胚胎用2.5uL 0.4%的三卡因麻醉。30分钟后，斑马鱼32g离心1分钟，使其平铺在孔板底部。受精2天后的鱼用IsoCyte成像仪进行扫描，设置如表1。

表1. 用于斑马鱼扫描的IsoCyteTM仪器设置

IsoCyte设置	血管生成分析	急性毒性分析
激发光源	488纳米激光	488纳米激光
GFP发射	510-540纳米	510-540纳米
激光扫描发射	475-485纳米	475-485纳米
扫描面积	3200×3200微米（比整孔大10%）	3200×3200微米（比整孔大10%）
分辨率	5×5微米	5×5微米
数据平均	2均值/像素	1均值/像素

IsoCyte数据除了保存为MDCStoreTM（数据库）兼容的单个TIF文件外，还自动保存为一平板原始图像。将TIF图像从数据库导入到MetaMorph®或MetaXpress®软件中，使用包含神经突生长模块的简单期刊进行分析，该模块适用于计数从尾巴主血管发芽的荧光血管。

图1. MetaXpress®软件中的神经突生长模块

急性毒性分析程序

胚胎在受精1天后由Zygogen去氯离子。在受精2天后收到，按384孔板每孔1个胚胎转移到40 uL的溶液中。胚胎按照每个剂量7复孔按列排列。将40uL 2倍浓度的6种化合物加入适当的处理孔中，并将胚胎在28℃下孵育24小时。扫描前30分钟，通过加入5uL的0.4%三卡因麻醉胚胎。将鱼在32g下离心1分钟以使其平铺在孔底，受精3天后的鱼用IsoCyte成像仪进行扫描，仪器设置如表1。

IsoCyte®数据除了保存为MDCStoreTM（数据库）兼容的单个TIF文件外，还自动保存为一平板原始图像。将TIF图像从数据库导入MetaXpress®软件进行分析，使用journal进行分析，该journal使用组合的荧光和散射图像创建掩模（mask），然后报告形态测量参数 （例如长度）以及强度测量。

结果

血管生成分析

整个384孔板在IsoCyte®成像仪上扫描并保存在8分钟内完成。荧光和散射图像可以在采集时查看。参见图2，查看具有Vatalanib剂量反应的斑马鱼GFP图像的示例。

图2. 在增加Vatalanib剂量的荧光图像中尾血管分支发育的抑制很明显。

用户可以选择在IsoCyte成像仪上扫描后要自动保存的6种不同文件类型中的哪一种。该扫描被保存为单个680 MB原始数据文件（384孔中的2个波长）和TIF图像文件夹，以便于导入MetaMorph®软件。创建了一个MetaMorph®分析journal，该journal裁剪了图像并利用Neurite Outgrowth应用模块来识别和定量尾部的荧光血管。图3显示了分析的步骤。用journal自动分析整个孔板的图像，并将数据输出记录到数据库文件或Excel电子表格中。

图3. MetaMorph®血管生成图像分析示意图。

绘制了计数血管的数量。图4显示了根据DMSO对照校正的平均结果。误差线表示重复的标准误差。对血管形成的抑制与在Zygogen观察到的结果一致。

图4. 随着药物剂量的增加，尾血管形成减少。

急性毒性分析

由于急性毒性测定依赖于胚胎体内的显而易见的形态变化，因此在扫描过程中没有进行像素平均，并且在4分钟内对整个384孔板进行了成像和保存。图5是在IsoCyte成像仪上采集的GFP和散射图像的叠加图。

图5. 随着剂量的增加，毒性作用是可见的。激光散射信号增加而GFP强度降低。

通常，急性毒性作用被测量为由于生病胚胎发育迟缓或卷曲而导致的总胚胎长度差异。这种分析可以通过将IsoCyte图像导入MetaXpress®软件并使用集成形态测量分析来测量长度来完成。将长度平均值与采集过程中分析的图像的散射强度进行比较。图6表明，在这种情况下，散射强度是急性毒性的最佳指标。图7显示了使用IsoCyte软件测定的总激光散射信号对6种化合物的毒性影响。

图6. 随着剂量的增加，毒性作用是可见的。激光散射信号增加比鱼长减少更明显。

图7. 激光散射信号显示了6种不同化合物的毒性作用的比较。

总结

IsoCyte®激光扫描成像仪非常适合在激光散射和荧光中同时快速采集斑马鱼图像，而无需耗时的聚焦步骤。使用IsoCyte软件的即时分析实现了自动斑马鱼毒性筛查。使用MetaXpress®软件和现有应用模块以半自动方式完成血管生成的复杂图像处理。