— 概述 —
因近期的新冠疫情，疫苗的研制变成了全球各国人民关注的焦点，本文以疫苗研制过程中的细胞培养过程为例，就PAT技术如何助力疫苗研制，保证疫苗的有效性和安全性，进行初步探讨。希望对大家有所启示。
（国内新冠疫苗在研情况信息汇总，见附件）
图片来源—AZPWorldwide/Shutterstock
一
引文
从官方通报的首例新冠肺炎患者到现在，已经过去两个多月了，在这期间，全国人民都投入到了防护抗议的工作当中，疫情扩散情况得到了有效控制。新冠病毒疫苗什么时候能研制出来？成为很多人关心的问题。
近期，世卫组织总干事谭德塞表示，目前全球共有20多种新冠肺炎疫苗正在研发阶段，一些治疗方法正在进行临床试验。02月22日，浙江研发的第1批疫苗已进入动物实验阶段（处于临床前研究阶段），这些无疑都是利好消息。但从疫苗的研制流程（下图）来看，虽然新冠疫苗的研制时间已经得到了极大的缩短，距离疫苗的投产使用仍还有较长的一段时间。过程分析技术（ProcessAnalyticalTechnology，简写为PAT）作为一种新兴的过程控制技术，具有缩短工艺开发周期，监控产品质量，降低生产成本等诸多优势，近十几年被制药企业慢慢熟知并应用。下面我们将以疫苗研制过程中的细胞培养环节为例，初步探讨PAT技术的应用。
疫苗研制流程图
二
PAT技术简介
2004年，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了PAT白皮书《PAT-AFramework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing,and QualityAssurance》，给出了PAT技术的定义，如下图所示，即通过在生产过程中及时测量起始物料与过程物料以及工艺的关键质量与性能特性，并以确保成品质量为目标设计、分析与控制制造的系统。这里的“系统”包括软件和硬件。
基于产品质量的实时监控，企业可进一步加深对生产工艺的了解，借助严格的过程控制以及质量标准，PAT技术可以帮助企业实现产品质量的稳定一致和合格。我想大家对该技术应该并不陌生，在此不做详述，相关知识大家可以参见《重磅 | 新版《药品管理法》出台， QbD 和 PAT将成为技术新潮流》。近十几年，PAT技术被国外各大生物制药企业应用于研发和生产的工艺质量监测过程中，取得了良好的效果，但主要还是应用在上游工艺，包括培养基和克隆筛选以及培养过程监控等。国内因缺乏相关人才、工艺适用性等问题，应用较少，处于早期学习探索阶段，更多的是要参照国外的经验和技术。
三
PAT在病毒性疫苗-细胞培养阶段的应用
下图为典型的病毒性疫苗生产流程。目前法定一类二类病毒类人用疫苗的生产工艺过程中,有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原,其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中。
1967年，VanWezel开发了微载体并进而实现了贴壁细胞在生物反应器中的大规模培养，动物细胞生产病毒性疫苗也成为利用细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。发展到现在，疫苗研制过程中的细胞培养方式已经有转瓶、细胞工厂、微载体培养以及全悬浮培养。区别于批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转瓶和细胞工厂生产工艺，悬浮培养技术（微载体培养和全悬浮培养）不仅具有细胞密度高，培养基消耗量低以及批次之间稳定等优势，也使得细胞培养的过程质量监控成为可能。
细胞培养阶段作为确保产品质量的重要环节，从生物反应器接种开始，到接毒之前，培养时间一般维持在7-20天，细胞在这个过程中进行增值代谢，底物营养物质的浓度、中间代谢产物浓度、活细胞密度、OUR、CER、RQ和细胞形态等参数都会随之变化。如何通过PAT技术实现对中间代谢产物的实时监测（例如葡萄糖、乳酸以及铵根离子等），如何准确把握补料时间、补料量以及接毒的时间点，如何在生产过程中，建立标准化的控制策略，是我们切实关心的问题。
基于以上问题，必须要建立一种稳定可靠的在线监测方法。一般用于监测动物细胞培养过程的方法可分为两类：in-line（或on-line）和at-line（或offline）。in-line测量通常涉及与工艺设备相关联或接近的传感器，且测量相对连续，通常可用于闭环过程控制。而at-line的检测时间点是离散的，检测之前需要进行人工取样或联机自动取样，有时还要进行样品制备，耗时长，且有人为操作误差。已成功应用了几十年的温度在线传感电极、pH和DO在线传感电极就属于on-line检测范畴，称为on-line传感器，控制系统利用这些实时检测数据指示生物反应器通过添加补偿成分（即热、碱、氧）来维持预先设定的参数值。在生物制药发展的早期阶段，相比于温度、pH和DO电极，其他种类的在线监测设备，因为开发技术和产品需求等原因，迟迟未得到开发。
21世纪初以来，随着制药行业相关法律法规的相继出台，各国对于药品的研制和生产过程越来要高，PAT技术对于制药行业的重要性也越来越明显。各大制药供应商结合PAT技术和客户的需求，开发了一系列在线监测设备，包括活细胞计数仪、在线显微成像系统、质谱仪以及微热量计等，无疑使PAT技术从概念提出到实施落地，又近了一步。但PAT技术不仅仅是在线监测电极这么简单，还需要软件系统对得到的数据进行汇总处理和深度分析后，从宏观和微观等多个层次描述生物过程的特征，构成生物过程优化和控制研究的信息源，从中找出各个参数之间的相互联系，以跨越不同尺度的视角来分析生物代谢过程，才能达到优化生物过程和控制产品质量的目的。
四
应用案例介绍
近期瑞士Securecell公司推出了一款关于PAT技术的解决方案，主要针对细胞培养过程中的在线取样分析以及数据管理。下面我们以此为例，再结合培养过程中的一些难点，进行介绍。
Securecell公司，是瑞士一家专注于PAT技术的制药行业供应商，旗下产品硬件系统Numera，可以将多个（最多16个）生物反应器与多个各种类型的第三方分析仪器联通在一起，结合自主开发的软件系统LucullusPIMS，可帮助客户实现在线取样、样品处理、数据收集和报告编辑、工艺管理以及反馈控制等一系列自动化功能。
主要功能
CASE 1
实现在线取样和分析
传统的细胞培养过程，需要手动取样，有些样品后续还需要进行稀释过滤等操作，不仅存在增大染菌几率和人为操作导致仪器检测误差的风险，此外，一些种类的疫苗，在生产过程中，仍然具有很强的毒性，对操作人员存在安全隐患。
上图是Securecell公司以CHO细胞培养过程中，检测生化参数为例，进行的案例分享。Numera自动取样和样品处理系统，通过自带的无菌管路，将发酵罐和罗氏生化分析仪连通在一起，结合Lucullus软件系统，根据预先设定好的取样计划，通过Numera自带的取样/稀释/过滤/低温储存等模块，完成从发酵罐的取样和处理操作，然后将处理后的样品自动输入至生化分析仪，完成样品测量。此外，Securecell公司将离线测量和在线测量数据进行了比对，如下图所示，乳酸、葡萄糖以及铵根离子浓度对比有很好的吻合度。
Note：在线检测数据的图标：葡萄糖（浅蓝色），乳酸（红色）和铵（紫色），离线手动取样处理的样品结果以黑色标记
CASE 2
Lucullus PIMS 数字化工艺流程
传统的实验数据整理，是在得到大量的数据后，进行人为的统计汇总，并进一步进行不同维度的分析，最后形成报告。当需要比对历史数据时，更是让人头疼的事情，这项工作可能要花费一个工程师高达40%的工作时间。这种难题存在的原因，主要是因为实验室存在不同种类的反应器和分析设备，而缺少一款数据采集与监视控制系统（PCS和SCADA），在实验结束后，会生成大量数据，而且文件的种类和格式完全不同，需要人为统一汇总。
Securecell公司介绍到，LucullusPIMS作为一款功能强大的软件系统，可以脱离Numera，独立为客户带来多种解决方案，包括样品信息管理、培养基信息管理以及最重要的工艺数字化，完全可以解决用户在数据管理上的难点。
关于工艺数字化，该公司提供了部分图片案例展示，包括对在线数据的实时汇总功能，包括发酵罐和分析仪器的实时检测数据（图1），不同实验项目、批次、时间的数据对比和作图功能（图2）。
图1 整合所有的在线实验数据
图2 数据和报告整理
五
小结
PAT技术是实现质量源于设计(QbD)理念的重要工具之一，涉及多学科的交叉领域，本文只是就PAT技术在疫苗细胞培养阶段的应用进行了案例介绍。疫苗行业作为现代医药领域的一份子，在技术上、市场上以及政策上都有较高的壁垒，技术更新相对较慢。相信在未来的10年，随着疫苗需求的不断增加，以及生物技术水平的持续提高，PAT技术在疫苗生产中发挥的作用将越来越突出。
▉参考文献：
1. StanleyPlotkin, James M. Robinson, Gerard Cunningham. The complexity andcost of vaccine manufacturing-An overview, Vaccine 35 2017;4064-4071；
2. ANURAGS R. QbD/PAT for bioprocessing：movingfrom theory to implementation. Current Opinion in ChemicalEngineering，2014,6：1-8.
3. Simon, L. L. et al. Assessment of Recent Process AnalyticalTechnology (PAT) Trends: A Multiauthor Review. Org. Process Res.Dev., 2015, 19 (1), pp 3–62.
4. AlexandraHofer, Paul Kroll, Christoph Herwig. Glucose monitoring and controlusing Numera, Lucullus PIMS and Cedex® Bio HT Analyzer. FromSecurecell website.
5. 易小萍，动物细胞培养过程PAT和在线生物检测技术，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室；生物产业技术，2018；
▉附件 国内新冠疫苗在研情况汇总
2020年02月21日，国务院应对新型冠状病毒感染肺炎疫情联防联控机制举行新闻发布会，介绍科技创新支撑疫情防控有关情况。据悉，最快4—5月份可以有部分疫苗项目进入动物实验阶段。为方便大家了解具体的情况，小编将国内新冠疫苗的在研情况进行了汇总，供大家参考。
| NO. | 企业/机构名称 | 疫苗种类 | 合作方 | 最新进度 |
| 1 | 中国疾控中心 | mRNA疫苗 | 同济大学附属东方医院和斯微（上海）生物科技有限公司 | 动物实验 |
| 2 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 重组蛋白递呈多肽疫苗 | \ | 动物实验 |
| 3 | 浙江省疾控中心 | 灭活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、mRNA疫苗 | 浙大一院和杭州医学院（省医科院）等 | 重组蛋白疫苗研发，经第一批预实验小鼠测试，已产生抗体；mRNA疫苗：研发已进入动物实验阶段 |
| 4 | 香港大学医学院微生物学系 | 减毒活疫苗 | \ | 动物实验 |
| 5 | 智飞龙科马生物制药有限公司 | 重组蛋白亚单位疫苗 | 中国科学院微生物研究所 | 动物实验 |
| 6 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 多肽疫苗 | 清华大学药学院 | \ |
| 7 | 深圳康泰生物制品股份有限公司 | DNA疫苗 | 艾棣维欣（苏州）生物制药有限公司 | \ |
| 8 | 华兰生物工程股份有限公司 | 静注人免疫球蛋白 | \ | \ |
| 9 | 浙江天元生物药业有限公司 | \ | 浙江大学传染病诊治国家重点实验室 | \ |
| 10 | 三叶草生物制药有限公司 | S-trimer疫苗 | \ | \ |
| 11 | 冠昊生物科技股份有限公司 | mRNA疫苗 | 美国ZY Therapeutics | \ |
| 12 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 植物源蛋白疫苗 | 美国iBio公司 | \ |
| 13 | 苏州艾博生物科技有限公司 | mRNA疫苗 | \ | 即将进入动物实验 |
| 14 | 武汉博沃生物科技有限公司 | 病毒载体疫苗 | GeoVax Labs | 早期研究 |
| 15 | 苏州宇之波生物科技有限公司 | 重组蛋白疫苗 | \ | 早期研究 |
| 16 | 药明生物技术有限公司 | 中和抗体疫苗 | \ | \ |
| 17 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | mRNA疫苗 | \ | \ |
| 18 | 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室 | mRNA疫苗 | 浙江特瑞思药业股份有限公司、成都国家GLP中心、四川省人民医院以及国药成都生物制品研究所等单位 | 即将进入动物实验 |
此外，还包括以下公司，但未查到相关研究进展：中国生物技术股份有限公司、北京科兴生物制品有限公司、康希诺生物股份公司、中国医学科学院医学生物学研究所、北京艾美生物疫苗技术集团有限公司、云南沃森生物技术股份有限公司、北京生物制品研究所有限责任公司、成都生物制品研究所有限责任公司、北京祥瑞生物制品有限公司、罗益（无锡）生物制药有限公司、北京民海生物科技有限公司、长春卓谊生物股份有限公司、中科生物制药股份有限公司、中逸安科生物技术股份有限公司以及贝达药业股份有限公司。
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