应用领域:蛋白/抗体/蛋白质组
检测样品:生物发酵
检测项目:分离纯化
抗体纯化产品解决方案
蛋白纯化系统——酶标仪
制备出效价高,特异性强,稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础,抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败,不同的免疫学实验方法(如ELISA,IHC,IP,ICC,SDS-PAGE, WB等)对抗体的效价,浓度和纯度有不同的要求。我们知道,一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体,血清蛋白以及其他各种杂蛋白等,在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后,我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。
一、 抗体简介
抗体属于免疫球蛋白,免疫球蛋白都有一个共同的组成,既有两条类似重链和两条轻链,结构示意图见图1。
图1 典型的H2L2抗体结构以及Fab片段和F(ab)2片段结构
根据重链的不同,免疫球蛋白可以分为5个类型,轻链也有2个不同的类型,具体见下表。
性质 | IgG | IgM | IgA | IgE | IgD |
重链 | γ | μ | α | ε | δ |
轻链 | κ或λ | κ或λ | κ或λ | κ或λ | κ或λ |
结构 | 单聚体 | 五聚体 | 单聚体或双聚体 | 单聚体 | 单聚体 |
表1 免疫球蛋白的类型
二、 分离提取抗体时常用的缓冲液和添加剂
常用浓度 | 目的 | |
缓冲液类型 | ||
Tris | 20mM,pH7.4 | 维持pH |
NaCl | 100mM | 维持离子强度 |
EDTA | 10mM | 螯和金属离子 |
蔗糖或葡萄糖 | 25mM | 维持溶酶体外膜 |
表面活性剂 | 稳定膜蛋白 | |
DNA水解酶 | 1μg/mL | 降解DNA |
蛋白酶抑制剂 | ||
PMSF | 0.5-1mM | 抑制丝氨酸蛋白酶 |
APMSF | 0.4-4mM | 抑制丝氨酸蛋白酶 |
Benzamidine-HCl | 0.2nM | 抑制丝氨酸蛋白酶 |
Pepstain | 1μM | 抑制丝氨酸蛋白酶 |
Leupeptin | 10-100μM | 抑制半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶 |
Chymostain | 10-100μM | 抑制一凝如蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶 |
Antipain-HCl | 10-100μM | 抑制半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶 |
EDTA | 2-10mM | 抑制金属蛋白酶 |
EGTA | 2-10mM | 抑制金属蛋白酶 |
还原剂 | ||
DTT | 1-10mM | 保持半胱氨酸的还原性 |
DET | 1-10mM | 保持半胱氨酸的还原性 |
TCEP | 1-10mM | 保持半胱氨酸的还原性 |
其他试剂 | ||
甘油 | 5%-10% | 稳定蛋白质 |
三、 样品前处理
抗体培养物可能来源于人类血清、杂交瘤细胞悬浮培养物、微生物(最常见是大肠杆菌),因此首先进行细胞破碎(胞内重组表达),如果是胞外产物,这一步可以忽略。
再进行固液分离(离心或者超滤),如果抗体是包含体的话,在这一步可以考虑增加稀释复性这一步骤,如果觉得稀释复性的得率低,可以把复性这一步移至色谱分离步骤里面,进行柱复性。另外在这一步骤里,还需添加右旋葡糖酐和氯化钙或者固体PVP,用来沉淀除去脂质和脂蛋白,它们会堵塞柱子。以及可以通过脱盐柱或者硫酸铵分级沉淀,除去小分子杂质。
最后再进行微滤。微滤的目的是除去一些更小的颗粒物质,防止其堵塞柱子。
上海闪谱针对这一步骤中所需的仪器——如离心机、超声破碎仪等等正在紧张研制中,不久将陆续推向市场,与客户们见面。
四、纯化策略
1、如果采用脱盐除去小分子
我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统(图2),以及各填料公司生产的脱盐柱(该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配)结合起来,完成脱盐这个步骤。典型的脱盐色谱图3如下所示:
图2 上海闪谱Clear-First系列蛋白纯化系统中的一款,Clear-First-2000型
图3 典型的脱盐色谱图
2、如果采用硫酸铵分级沉淀除去小分子
在这一步得到的蛋白沉淀,除了可以按照前述方法进行脱盐之外,还可以考虑接下来可以使用HIC色谱分离。
3、抗体纯化
(1)第一步——亲和色谱
Protein A和Protein G是从Streptococci和Staphylococcus aureus分离的细菌蛋白,它们可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上,当抗体培养物从中流过时,特异性的IgG就与配基结合,其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同,我们需要具体情况具体对待,分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,猪的多克隆抗体用protein A纯化,而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。
另外,蛋白质L对Igs的X轻链具有高亲和力,可纯化完整抗体和抗体的片段。因此,可用其对IgM和Fab及F(ab)2片段进行纯化。除了这些特性,我们还发现纯化结果不稳定,并且其半衰期短。但是,蛋白质L是一种替代型“广谱”抗体纯化基质。蛋白质L与免疫球蛋白的K轻链结合,这对于纯化抗体片段及完整的IgG、IgM和IgA很有用。
我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统(图2),以及各填料公司生产的G蛋白或A蛋白柱(该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配)结合起来,完成亲和色谱这个步骤。典型的亲和色谱图4如下所示:
图5 利用Blue Sepharose除去白蛋白
(3)第三步——凝胶过滤色谱
抗体在制备过程中,经常会聚合成二聚体或者多聚体,这些多聚体会显著降低抗体的生物学活性。我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统(图2),以及各填料公司生产的高分辨率分子筛柱(该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配)结合起来,完成这个步骤。典型的去杂如图6如下所示:
图6 利用Superdex 200/10 300 GL去除二聚体和多聚体
五、抗体的检测
根据蛋白纯化系统软件上的出峰位置,从自动收集架上有选择性的选取部分样品管进行SDS-PAGE(蛋白电泳)验证,考马斯亮蓝染色,观察条带的分子量大小与抗体分子是否吻合,观察是否还有其他的杂带,若有杂带,估测下所需蛋白的含量,一般超过90%就不需要进一步的纯化,只需要进行脱盐处理即可(有时可能还需要切掉标签蛋白部分)。若想对所得蛋白进行更进一步的验证,Western blot,将蛋白转至NC膜上,用标签抗体或该蛋白的特异性单抗进行孵育,清洗后,再孵育上带有HRP的二抗,再一次清洗后,就可以将NC膜放进化学发光成像系统中,再讲混合好的A、B液滴在膜上,就可以用化学发光成像系统进行拍摄,观察产生条带(斑点)位置,浓淡等,从而进一步验证蛋白的正确性。
得到纯的蛋白后,最后一般都要进行浓度的测定,现在最普及的是用BCA试剂盒测定,按操作说明加好孵育后,用酶标仪(上海闪谱生物,ReadMax 1900全波长光吸收酶标仪,见图7)在562 nm处读取OD值,在通过酶标仪上的结果处理,即可计算得出待测蛋白的浓度,无需人员通过EXCEL自己计算。这样就基本完成了蛋白分离纯化的整个过程。
最后酶免疫分析,如ELISA,是免疫分析的主要部分。理解了ELISA的实验原理,就可以理解其他以抗原-抗体反应为基础的实验原理。ELISA方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和性、浓度及灵敏性。下面是一个进行直接或间接ELISA的典型的操作步骤。直接与间接ELISA的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中,一抗是酶标抗体;在间接分析中,一抗不是酶标抗体,酶标记在识别一抗的二抗上。
图7上海闪谱生物ReadMax 1900全波长光吸收酶标仪
ELISA实验的典型操作步骤:
(1) 在进行分析前,应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如,如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定,我们常常是仅在奇数孔包被抗原,而如果是进行杂交瘤的阳性筛选,除了一个或者两个孔留作空白对照外,我们将整块板包被抗原。
(2) 进行分析前最好过夜包被酶标板。这样,目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4℃,最长时间可达2周。用包被缓冲液稀释配体至2〜5μg/mL。每个孔用0. 1ml的稀释配体进行包被。
(3) 进行分析时,从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体,用洗涤缓冲液洗整块孔板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。
(4) 向所有孔中加 300 μL的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30 min,然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。
(5) 在封闭孔板的同时,用PBS稀释一抗。如果是筛选抗血清,我们通常进行 5 倍的倍比稀释,起始点为 1: 50或 1 : 100。如要检测培养上清,进行2倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清,不要做任何的稀释。
(6) 如果一抗是酶标抗体,可将其进行 1 : 100〜1 : 10000稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。
(7) 向孔中加人 100W稀释的抗体。对于系列稀释的抗体,最好每个稀释度加双份孔(一共4个孔)。37℃孵育孔板 30min。
(8) 孵育后,用洗涤缓冲液洗板 3 次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。
(9) 如果向孔板加入的是酶标一抗,越过此步而直接进行步骤10。 间接分析中,向所有的孔中加人 100