蛋白与配体能否结合、结合的强弱会直接影响蛋白检测或纯化实验的成败。此篇文章由月旭科技首席科学家王国斌博士执笔，对蛋白结合和解离常数进行了较为系统的讲述。

蛋白和配体结合的强弱不同，对于蛋白检测以及亲和分离纯化实验有显著影响。在设计实验时应考虑这种结合强弱影响，以便采用合适的蛋白或配体浓度（包括zui低检测限浓度），估算结合时间，获得zui佳并且实用的结果。 这对于室温下易失去活性，或希望尽可能保持zui高活性蛋白的纯化尤为重要。

常规的蛋白检测方法，比如ELISA，只能测定实验结束时的蛋白结合数值，不能跟踪整个过程。这不利于获取结合的动力学数据，阻碍了实验的优化。自从上个世纪90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技术后，目前已有几种生物传感器技术，能够跟踪蛋白和配基的real-time结合过程，检测结合的全部过程，给出结合的动力学数据。下图是我在SRU Biosystems用光学生物传感测定蛋白A和不同浓度人类IgG随时间变化的结合曲线。IgG浓度在100μg/mL时，结合在2-3分钟内迅速上升后，缓慢增加。在浓度减小时，结合速度变慢。浓度在6.25μg/mL时，结合在180分钟内持续稳定地增加。浓度小于1μg/mL时，结合仍然进行，但是十分缓慢。

 

图1. 10种浓度的人类IgG与光生物传感器表面

的蛋白A结合的real-time时间曲线。

IgG浓度从100μg/mL，做1:2稀释，

直到0.09μg/mL（90ng/mL）和0对比。

绝大多数生化实验室，没有real-time跟踪检测手段，蛋白检测或者纯化过程中，确定蛋白的浓度和结合时间通常根据结合的强弱来确定，而结合强弱是通过解离常数来判断的。

在化学、生物化学中，解离常数（KD) 是一种反应的平衡常数，用于测量较大物体可逆地分离（解离）成较小成分的倾向。解离常数是结合常数的倒数。 虽然解离常数是动力学理论的参数， 但是它在生物化学，尤其实验设计上有现实意义的指导作用。

对于一个可逆的蛋白结合过程

（1）P+L⇌P L

PL是蛋白P和配体L的亲和产物。解离常数KD定义为

（2）KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA

其中[P]e’[L]e和[PL]e分别是到达平衡时，P、L和结合物PL的浓度。KA是结合常数。结合率ϴ定义为蛋白P与配体L结合成PL的比例。

（3）ϴ=[PL]_e/[P]t 

[P]t是起始的蛋白P总浓度。平衡时蛋白浓度

（4）[P]e= [P]t-[PL]e 

等式（2）变成

 (5) KD=（[P]t-[PL]_e）[L]e/[PL] 

等式（5）变成

(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)  

结合率ϴ转化为  

（7） ϴ=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)

平衡时省余未结合配体浓度

（8）[L]e=ϴ KD/(1-ϴ)                         

当蛋白L有一半结合时，ϴ=0.5

（9） [L]e=KD                                     

zui后平衡状态结合配体的浓度就等于解离常数。下面阐述其实用价值。

图2. 不同配基浓度和蛋白结合率ϴ。

KD=1nM——；KD=5nM——

例如KD为1nM时，zui后剩余的配基平衡浓度为1nM，一半的蛋白会与配体结合（ϴ=0.5）。KD为5nM时，zui后剩余的配体平衡浓度为5nM时，一半的蛋白会与配体结合（ϴ=0.5）。如果想要提高蛋白结合率到六成（ϴ=0.6图中紫线），就要增加配基浓度，达到zui后配基平衡浓度分别为1.5nM（KD=1nM）和7.5nM（KD=5nM）。对于蛋白A填料来说，配体就是抗体，不同动物/总类的抗体有不同的KD。如果给与足够时间，结合达到平衡后（静态载量），没结合抗体的浓度也不同。KD小，会有更高的静态载量，分离得更完全。 要想提高低KD抗体的载量，只能提高填料表面蛋白A的密度。如果时间短，没有达到zui后的结合平衡，现实的例子就是抗体流过蛋白A填料柱。在相同时间里，KD小的，会有更多的抗体与蛋白A结合。对于同样的KD流速低，时间长，动态载量也会更高。

反之， 在zui后配体平衡浓度为8nM（图中红线）时，KD小（1nM）的蛋白结合率能达到0.89，而KD大（5nM）的蛋白结合率只有0.62。 这对于无蛋白检测时，试剂浓度选定有帮助。比如ELISA的二抗（检测抗体）或者荧光标记的二抗以及链霉亲和素（Streptavidin）浓度确定后，KD对蛋白（被检测物）的浓度测定的影响就显而易见。KD小的被检测蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，结合率高，检测结果更准确。如果KD较大，就要提高二抗浓度，以确保检测数据可信度，或者缩短实验周期。

 

图3. 蛋白结合强弱划分定义

在分子生物学上，KD<10-8M (10nM或者0.01μM)属于强结合； 10-4M>KD>10-8M属于中等结合；KD>10-4M (0.1mM)属于弱结合。蛋白A与不同种类抗体结合的强弱不同。例如protein A与人类IgG1、IgG2和IgG4的KD约为2×10−9M，属于强结合。下表列出不同抗体与蛋白A结合的强弱情况。蛋白检测，分离纯化过程中，应该参照结合强弱，设计操作方案。

 

链霉亲和素（streptavidin）是生物化学常用的试剂。它于生物素（biotin）结合的KD非常小，仅为~10−14M。 强度与共价键类似。前文介绍过，链霉亲和素是非常稳定50KD蛋白，经常用来与荧光、红外、ELISA标记等化学结合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，带有羧基的小分子。 容易与蛋白化学结合。这样带有标记的链霉亲和素，与带有生物素的蛋白结合，从而避免直接标记蛋白。链霉亲和素和生物素KD小。对比于直接标记二抗的方法，采用标记的链霉亲和素-生物素的方法用量小、时间短，达到准确检测的目的。基于这种原因，标记的链霉亲和素、化学活化的生物素以及生物素结合的二抗等蛋白检测试剂，比较容易购买，这对于实验方案设计非常便利。

作者✦

 

王国斌，美籍华人博士，在生命科学和表面化学领域有着20多年的产品研发经验。拥有反相表面聚合技术等多项发明专利，并有GRAFT-COAT™涂层技术和蛋白质的HydroGel™涂层载玻片等多款专利产品面世。曾就职于多家医疗器材和生物科技公司，包括Perkin Elmer和SRU Biosystems，参与开发了 BIND™生物传感器。

王国斌博士凭借在高分子化学、表面科学、蛋白质兼容表面等方面的丰富经验，在加入月旭科技后，主持研制了“续净一号”银离子消毒液，并对月旭科技的蛋白纯化系列产品的研发提供了ji大的技术支持。为今后月旭科技在生命科学领域的发展注入一剂强心针。

领域：蛋白/抗体/蛋白质组,多组学/蛋白质组/代谢组/脂质组