离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics™是在3D分离即保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度的基础之上增加了第四个维度，离子淌度（mobility）的分离（图1），进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

图1. 新一代4D-蛋白质组学示意图

骨骼肌（musculoskeletal）蛋白质组学研究挑战

骨骼肌中含有丰富的肌球蛋白（Myosin），肌动蛋白（Actin），肌联蛋白（Titin），占总蛋白的25%。这些蛋白质相互作用完成了肌肉的收缩与舒张。在人类基因组中有超过40个肌球蛋白基因编码12类不同的蛋白质。肌联蛋白是已知的最大的蛋白质，有超过35000个氨基酸，分子质量高达3mDa，经胰蛋白酶消化可产生超过3000多条肽段。

图2. 肌节的二维图示：显示肌球蛋白、肌动蛋白和肌联蛋白

自下而上（Bottom-up）的蛋白质组学分析方法受限于骨骼肌样品中的高丰度蛋白，如肌球蛋白和肌联蛋白，它们产生数以万计的冗余肽段信息。在基于数据依赖采集（DDA）的模式中，大量的质谱时间都花在少量却丰度高的多肽上，而不是增加蛋白质组覆盖的深度。为了得到更深的骨骼肌蛋白组覆盖深度，通常采用二维液相分级，分为不同馏分来增加蛋白鉴定量。

图3是采用传统蛋白组学平台分析肌肉组织样本，经过TMT标记后，再预分级为12个样本，总共可以鉴定到2190种蛋白质（图3A），19986个肽段信息。但在谱图与肽段的匹配中（PSMs）可以发现，55%的肽段信息属于前15种高丰度蛋白（图3B），其中包括肌动蛋白、肌球蛋白、肌联蛋白等，前15个高丰度蛋白鉴定结果见表1。

图3. 采用传统蛋白组学平台分析肌肉组织样本结果

表1. 肌肉组织中TOP15高丰度蛋白鉴定信息

实验设计与结果

样本

肌肉组织样本：提取蛋白并酶解后，肽段经过高pH进行预分级，得到9个组份。

分析条件

传统蛋白质组学质谱平台采用180min梯度的色谱方法；

4D-蛋白质组学平台采用90min梯度的色谱方法。

结果

相对于传统蛋白质组学技术，基于timsTOF Pro的4D-蛋白质组学平台因为更多快的采集速度和更高的灵敏度，可以采用更短的色谱梯度而鉴定到更多的蛋白质。

图4A显示，timsTOF Pro采用90min的方法，可鉴定到3478种蛋白质，比传统蛋白质组学平台（2222种蛋白质）要高出56%，而使用的时间却减少了一半。

图4B和图4C也显示出timsTOF Pro超过120Hz的采集速度在肽段和PSMs上的鉴定优势也非常明显（特征肽段鉴定数量增加了三分之一，肽谱匹配数（PSMs）增加了一倍）。

图4. 不同蛋白质组学平台分析结果比较。A. 蛋白鉴定数目比较；B. 多肽鉴定数目比较；C. PSMs数目比较

面对高丰度蛋白的影响，样品分馏可以降低样品分析的复杂程度，提高蛋白质和肽段信息的鉴定数量。将预分级技术与布鲁克4D-蛋白质组学技术结合，则可进一步提高样本鉴定深度，通过不同维度组合对骨骼肌样本分离分析，将为寻找人类疾病生物标志物提供新的数据深度。

参考文献：

• Emma Doud et al., Deeper proteome coverage of musculoskeletal samples，ASMS 2020

• Herzog, Walter. “The multiple roles of titin in muscle contraction and force production.” Biophysical Reviews vol.10,4 (2018): 1187-1199.

• Mosley, Amber et al. “A label free quantitative proteomic analysis of the Saccharomyces cerevisiae nucleus.” Journal of Proteomics vol 72,(2009):110-120.

• Meier, Florian et al. “Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.” Molecular & Cellular Proteomicsvol. 17,12 (2018): 2534-2545.

领域：蛋白/抗体/蛋白质组,临床生物化学/分子生物学

标签：布鲁克,质谱,4D-组学,骨骼肌,蛋白质组学