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助力基因治疗-SCIEX毛细管电泳多重表征整体应用方案

2021-04-27 11:35SCIEX

基因治疗可以在DNA和mRNA水平上对致病基因进行修正从而达到治疗效果,相对于传统药物,对于一些成药性较差的靶点具有独特优势,因此基因治疗对于特定基因引起的疾病有极大的应用潜能,其中肿瘤和罕见病是基因治疗最主要的应用领域。在中国,基因治疗药物Gendicine于2004年获得国家食品药品监督管理局的批准上市,成为世界上首个获批上市的商业基因治疗产品。2005年,溶瘤病毒产品Oncorine也在中国获批上市,目前,已有300余个基因治疗产品已经上市或正在FDA和EMA的监管下进行开发,这些基因治疗产品都涉及持续的编码蛋白质DNA转移,并利用了多种体内和体外技术。

使用毛细管电泳SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,可广泛应用于基因治疗中的质粒DNA纯度分析、腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的纯度分析、腺相关病毒的等电点分析、宿主细胞残留DNA的片段分布分析等许多方向,并具备以下优势特点:

  • 分离度好:可基线分离超螺旋、开环及线性的质粒,可基线分离AAV的VP1、VP2、VP3蛋白,易于产品的定量及质控;

  • 重复性好:超螺旋质粒:迁移时间相对标准偏差(RSD)<0.5%,校准峰面积RSD<2%;AAV衣壳蛋白:迁移时间RSD<0.5%,校准峰面积RSD<5%;AAV等电点:pI的RSD<0.2%, 峰面积RSD<2%。

  • 灵敏度高:使用激光诱导荧光的检测模式等,可提供超高的检测灵敏度;

  • 操作简单:具有商品化的试剂盒,自动化程度高;

  • 适用范围广、方法灵活度高:适用于不同大小范围的质粒的分析;针对不同血清型AAV,可优化方法得到更优异的纯度和等电点分析结果;

  • 符合法规:仪器具有操作(OQ)认证,操作软件能够进行权限设置和审计

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图1. SCIEX PA 800 Plus药物分析系统与试剂盒

01.毛细管凝胶电泳法(CGE-LIF)对质粒DNA的纯度分析

质粒DNA作为基因制剂的传递载体,被广泛应用于基因治疗、细胞治疗、疫苗等生物制品领域。质粒DNA主要有三种拓扑结构,超螺旋、开环和线性形式。超螺旋质粒在细胞转染及基因表达方面优于其他形式,所以,高质量、高纯度的超螺旋质粒DNA是确保基因制剂安全性和有效性的前提条件。欧洲药物评审组织(EMEA)在关于“慢病毒载体的生产与开发”指导方针中指出,有必要在慢病毒载体的生产中使用高质量的质粒DNA。美国食品药品监督管理局(FDA)用于基因制剂质粒DNA指导意见的要求,超螺旋质粒百分比需大于80%。我国《生物技术药物研究开发和质量控制》一书中指出,对于质粒类生物制品超螺旋比例一般要大于90%。在质粒的研发和生产过程中,质粒的纯化工艺研究,制剂配方工艺研究,大规模生产的批次一致性,都需要对质粒的超螺旋结构进行质控检测。使用SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,结合激光诱导荧光检测器(LIF)和dsDNA 1000 试剂盒(货号477410),可以对质粒的三种拓扑结构进行高效分离,并能准确计算超螺旋百分比,用于质粒的纯度检测(图2)。

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图2  CGE-LIF方法分析质粒的纯度

02.CE-SDS-LIF方法测定腺相关病毒衣壳蛋白的纯度

腺相关病毒(AAV)是常用于细胞/基因治疗的载体,由衣壳蛋白及包装的核酸组成。AAV具有表达时间长、特异性强、安全性高、免疫原性低等优势,是细胞/基因治疗中重要的组成部分。AAV衣壳主要分为VP1、VP2和VP3三种蛋白构成,三种衣壳蛋白的纯度分析是AAV产品质量和安全的重要检测项目;而AAV产品具有多种血清型,且普遍浓度较低,需开发一种针对不同血清型均具有较高分离度和灵敏度的分析方法。SCIEX PA 800 Plus药物分析系统连接激光诱导荧光检测器(LIF)(图1)并使用SDS-MW分子量测定试剂盒是分析AAV衣壳蛋白纯度的有效方法,检测结果如图3。

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图3. CE-SDS-LIF方法分析AAV衣壳蛋白的纯度

03.毛细管凝胶电泳法(CGE-LIF)分析宿主细胞残留DNA的片段分布

生物制品中的疫苗、重组蛋白药、抗体药等产品多采用连续传代的动物细胞株表达生产。虽然经过严格的纯化工艺,但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些宿主细胞残留DNA(HCD)可能带来传染性或致瘤性风险。现有研究表明,一个功能基因至少在200 bp以上,因此残留DNA片段越大,风险等级越高。美国食品药品监督管理局(FDA)关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp;国家药品监督总局(NMPA)生物制品药学部同样在基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则的征求意见稿中指出,HCD的片段要小于200 bp。因此基因治疗终产品中需要合适的方法检测HCD的片段大小分布情况。使用SCIEX PA 800 Plus药物分析系统,结合激光诱导荧光检测器(LIF)和dsDNA 1000 试剂盒(货号477410),可对HCD进行片段分布检测(图4)。

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图4 CGE-LIF方法分析DNA片段标准品的大小

04.cIEF方法测定腺相关病毒的等电点

腺相关病毒(AAV)是由结构蛋白与内部核酸物质组成复制缺陷性病毒,由于其具有表达时间长、特异性强、安全性高、免疫原性低等优势,被广泛认为是介导基因治疗的理想载体之一。病毒颗粒的衣壳表面暴露的氨基酸侧链决定了AAV具有特定的等电点(Isoelectric Point,pI),内部核酸的填充情况会造成AAV等电点的差异。AAV是通过重组表达生产,不同的血清型及病毒构建的不完整性均可影响产品的等电点,因此等电点的特性可用于鉴别和监控AAV的种类和产品质量。SCIEX PA 800 Plus药物分析系统与cIEF等电点测定试剂盒可以直接分析完整病毒颗粒,不存在污染毛细管或堵塞毛细管的情况,是测定AAV等电点的有效方法,检测结果如图5。

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图5. cIEF方法分析AAV的等电点

综上所述,SCIEX PA 800 Plus药物分析系统可广泛应用于基因治疗中的质粒DNA纯度分析、腺相关病毒衣壳蛋白的纯度分析、腺相关病毒的等电点分析、宿主细胞残留DNA的片段分布分析等许多方向,在同一平台上实现多重表征与应用,全面支持监管合规,为您的生物制品成功保驾护航。

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