自噬作为药物治疗的一个有前景的靶标

自噬及其失调已被发现在神经退行性疾病和癌症中发挥着重要作用，因此，在这个过程中发现新的治疗靶标已成为一种有前景的药物治疗方法。自噬是一种在细胞应激下降解和回收受损蛋白和细胞器的调控过程1，2。被称为自噬体的囊泡通过在标记为破坏的细胞成分周围形成双膜来进行组装1。自噬体囊泡随后与溶酶体融合，传递其内容物以供溶酶体水解酶降解。

自噬具有多种复杂的生理和病理生理作用，例如适应营养饥饿、清除受损的细胞内蛋白和细胞器、细胞发育、抗老化、消除微生物、细胞死亡、肿瘤抑制和抗原呈递2。线粒体分裂是自噬对线粒体的选择性降解3。该过程通常可以消除细胞损伤或应激后有缺陷的线粒体。

Materials

• PC12人神经母细胞瘤细胞系（ATCC）

• 384 孔板（Greiner）

• CYTO-ID® 自噬检测试剂盒（ENZO Life Sciences）

• 橙色线粒体染料

• Hoechst 33342

• ImageXpress® Pico自动化细胞成像系统（Molecular Devices）

• CellReporterXpress 数据采集和分析软件（Molecular Devices）

优势

定量化合物对自噬过程的影响

使用核标记物分割细胞，检测和表征小的目标物

使用自动成像确保可靠的统计结果

使用自动细胞成像检测和定量自噬体颗粒

评估对自噬的影响

这篇应用说明中，我们评估了ImageXpress Pico自动化细胞成像系统检测和定量自噬体颗粒的效率。PC12人神经细胞瘤细胞系被用作检测开发模型。将细胞以 6，000 个细胞/孔接种到384孔板中，孵育48小时。为了评估对自噬的影响，使用不同浓度的氯喹或维拉帕米处理细胞48小时。维拉帕米可以诱导自噬，而氯喹可以抑制导致颗粒累积的自噬体降解。化合物处理后，使用CYTO-ID®自噬检测试剂盒对活细胞进行染色，以示踪自噬体。此外，我们使用荧光线粒体染料检测线粒体，并使用Hoechst识别细胞核（浓度分别为 0.2 μM 和 1 μM）。使用搭配20X或40X物镜的ImageXpress Pico系统以及三个检测通道（FITC、TRITC 和 DAPI）对细胞进行成像。在 20X物镜下每个孔采集一张图像，在40X物镜下每个孔采集2-4张图像，以确保可靠的统计结果。使用CellReporterXpress图像采集和分析软件中的自噬或线粒体应用方案分析图像。

图 1：自噬体检测。上图显示了经过自噬诱导剂氯喹（30 pM）处理并使用Cyto-ID染料染色的PC12细胞的代表性自噬细胞图像和分析掩膜。在CellReporterXpress软件中，使用点分割识别自噬颗粒。细胞核显示为蓝色、线粒体显示为橙色，自噬显示为绿色。下图显示了使用橙色线粒体完整性染料对未处理细胞进行染色。用于线粒体检测的图像和分析掩膜。。

这些算法可以检测和表征小的目标物，如细胞质中的自噬体或线粒体，同时使用核标记来分割细胞。用于检测自噬的定量检测包括颗粒总数或平均数、颗粒（亚细胞对象）的总面积或平均面积以及强度。用氯喹（30 μM）处理后细胞的代表性图像和分析掩膜如图1所示。检测氯喹和维拉帕米处理后细胞的浓度反应，并评估EC50值。总自噬体计数的数据表明，氯喹和维拉帕米处理使细胞自噬水平分别增加4.6倍和3.3倍（EC50值分别为4.0和3.6 μM）。

结论

该方法与CYTO-ID染料结合可用于检测自噬颗粒，并可用于检测开发和定量化合物对自噬过程的影响。

参考文献

1. 

2. 1. Mizushima, N; Komatsu, M (2011). Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147: 728–41

3. 2. Mizushima, N; (2007). Autophagy: process and function, Genes & Dev. 21: 2861-2873