随着SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗的成功，mRNA 脂质纳米颗粒(LNPs)被推入核酸疗法的中心舞台 。mRNA疫苗的优势在于平台的模块化和快速大生产能力。。然而，设计优化mRNA-LNP疫苗时，需要平衡其有效性、稳定性和毒性，这时往往有多种选择。本文就最关键的考察因素提供了建议。

输入文字

输

介绍

一般来说，mRNA-LNP设计由几个要素组成：（1）mRNA序列设计和核苷酸修饰选择；（2）优化LNP配方以封装和递送mRNA；（3）长期储存。目前，对mRNA-LNP的评估基于表达编码mRNA的能力、细胞内RNA传感器识别外源mRNA的免疫原性、LNP制剂的稳定性和毒性。这些均根据给药途径和治疗目标进行检查。重要的是，用于全身给药的最佳治疗性mRNA-LNP的设计不同于最佳肌肉内给药的mRNA-LNP疫苗。我们将关注有效mRNA-LNP疫苗的表达、稳定性和毒性的优化设计，根据文献、我们已有的经验以及最近批准的两种SARS-CoV-2 mRNA疫苗，即Moderna的mRNA-1273和辉瑞/BioNTech的BNT162b2进行总结。

1.优化 mRNA-LNP 疫苗的 mRNA 序列和修饰

mRNA是蛋白质编码DNA的翻译和细胞质中核糖体产生蛋白质之间的中间步骤。（有语病）目前用于疫苗的RNA主要有：非复制的mRNA和病毒衍生的、自我扩增的RNA。传统的基于mRNA的疫苗包括编码目标抗原的序列， 5ʹ和3ʹ非翻译区(UTRs)，而自扩增RNA不仅编码抗原，还包括病毒复制序列，促使 RNA在细胞内扩增和增加蛋白表达。体外转录（IVT）mRNA是由一个包含T7、T3或Sp6噬菌体RNA聚合酶的线性DNA模板产生的。所得到的产物应该包含一个开放阅读框，编码目标蛋白质，侧翼UTRs，一个5ʹ帽和一个poly(A)尾。

mRNA序列和修饰选择的主要考虑因素是：(1)编码mRNA的表达；(2)由于细胞内RNA传感器将mRNA识别为外来实体而产生的免疫原性；(3)mRNA稳定性。这些可通过修饰核苷酸的引入、序列修饰和mRNA加帽方式控制（图1）。

图1   优化 mRNA-LNP 疫苗的 mRNA 序列和修饰

（1）核苷酸修饰

核苷酸修饰被认为是mRNA治疗领域的最重要突破之一。未修饰的mRNA分子被细胞内的RNA传感器识别，从而激活先天免疫。虽然通过佐剂激活先天免疫在疫苗接种时可能是有利的，但这些先天免疫反应也可能对mRNA治疗有损害，因为它们显著降低了mRNA翻译。2005年，Kariko及其同事进行的一项开创性研究表明，掺入天然存在的化学修饰核苷（如假尿苷(Ψ)、硫尿苷(s2U)和5-甲基胞苷(m5C)），可显著降低mRNA的免疫原性。更重要的是，一些研究表明，修饰核苷的掺入提高了RNA分子的稳定性，并增加了蛋白质翻译，包括已在mRNA-1273和BNT162b2中使用的N1-甲基假尿苷修饰。相比之下，CureVac的候选疫苗CVnCoV通过序列优化和未修饰的核苷实现稳健和平衡的免疫反应。然而，初步的2b/3期数据表明，该候选疫苗的效果明显低于辉瑞/BioNTech和Moderna的相关mRNA疫苗）（NCT04652102）。虽然CureVac候选疫苗的功效较差可归因于包含未修饰的核苷，但应考虑候选疫苗之间的其他一些差异，例如非编码元件和储存条件的差异（见表1）。因此，在考虑核苷酸修饰时，在由未修饰核苷驱动的潜在先天佐剂反应和由修饰核苷引起的蛋白质表达增强之间需要权衡。目前，两种FDA授权的mRNA疫苗都包含修饰的核苷酸。

表1   三种SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗的mRNA和LNP制剂成分的比较

（2）mRNA加帽

mRNA加帽通过与真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合，显著提高翻译效率和细胞内mRNA稳定性。体外转录(IVT)mRNA的加帽通常使用帽类似物进行，它可以在IVT过程或转录后添加。然而，mRNA可以反向加帽，导致快速降解和翻译不良。为避免反向5'帽掺入，已开发出抗反向帽类似物(ARCA)，可确保正确的加帽方向。为了提高ARCA的性能，多年来进行了进一步的改进，最近开发的“CleanCap”类似物在mRNA公司中最常用。因此，对于有效的mRNA-LNP疫苗，需要加入稳定的、正确定向的帽。

（3）UTR 选择

UTR的选择也应予以考虑，因为编码序列两侧的5ʹ和3ʹUTR元件深刻地影响了mRNA的稳定性和翻译。5'UTR特征如起始密码子和二级结构可能会折损核糖体募集、扫描和起始密码子识别，因此应予以避免。总之，5'UTR序列对蛋白质表达至关重要，而3'UTR可能影响mRNA半衰期。这两者都是疫苗关注的关键问题。这些调控序列可以来自病毒或真核基因，并大大增加治疗性mRNA的半衰期和表达。例如，β珠蛋白3'UTR和β-珠蛋白3'UTR稳定剂的重复被广泛用于稳定mRNA。

（4）开放阅读框（ORF）设计

由于细胞传感器的识别，ORF序列设计还对mRNA的翻译效率和免疫原性产生重要影响。除了前文提到的核苷酸修饰之外，用细胞质中含有丰富同源tRNA的常用同义密码子替换稀有密码子是增加mRNA蛋白质产量的一种常见做法，尽管这个模型的准确性受到了质疑。序列优化的另一种形式是富集鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量，这已被证明可以提高体外的稳态mRNA水平和体内的蛋白质表达，并且已被CureVac用于其最近的SARS-CoV-2mRNA疫苗候选疫苗CVnCoV（NCT04652102）。此外，mRNA序列可以通过改变密码子组成或引入修饰的核苷来正向调节，但这些形式的序列工程也决定了二级结构，这种二级结构可以通过水解影响mRNA降解。导致翻译和蛋白质同时折叠的动力学和准确性，以及在替代阅读框中存在的隐性T细胞表位的表达。所有这些因素都可能潜在地影响免疫反应的大小或特异性。据报道，专门设计的算法可以为最大碱基堆叠区域设计最佳mRNA序列，从而提高mRNA稳定性。

（5）Poly(A)尾

Poly(A)尾通过降低RNA核酸外切酶活性而有助于mRNA翻译和稳定性。因此，一个多聚(A)的最佳长度必须直接从编码的DNA模板或使用poly(A)聚合酶添加到mRNA中。密码子的使用还对蛋白质的翻译有影响，poly(A)尾与poly(A)结合蛋白(PABP)结合，后者募集eIF4G和eIF4E，增加对mRNA帽的亲和力并促进环状mRNA结构和有效翻译。PABP也被证明参与microRNA介导的翻译抑制。关于poly(A)尾的长度还没有达成共识。虽然有人认为较长的poly(A)尾（120-150个核苷酸）增加了mRNA的稳定性，但PABP介导的翻译抑制的双重作用需要进一步优化。例如，Lima等人证明了具有高翻译效率的mRNA实际上具有短的poly(A)序列（33-34个核苷酸）。由IVT产生的mRNA可以通过两种方式进行多聚腺苷酸化：要么通过编码所用DNA模板上的poly(A)，要么在IVT后通过poly(A)聚合酶酶促添加到mRNA。在DNA质粒上编码poly(A)尾确保产生确定的poly(A)尾长度，而mRNA的酶促多腺苷酸化产生不同长度的poly(A)尾，因此不太有利。

2. 用于mRNA递送的脂质纳米颗粒(LNPs)

脂质纳米颗粒是基于脂质的智能的纳米大小的载体，用于将mRNA输送到细胞。除了在系统循环中保护mRNA不受RNA酶的影响外，这些颗粒状的纳米载体可以通过与早期内涵体的脂质双分子层融合而有效地在细胞内递送mRNA。

（1）LNP 配方

LNP，即mRNA载体，既能保护mRNA有效载荷免于降解，又能使它们有效地递送到靶细胞中。通常，LNP是一种脂质制剂，由各种比例的中性结构脂质、胆固醇、PEG-脂质和可离子化脂质组成。

可电离脂质

可电离的脂质被认为是最重要的成分，通常将不同的mRNA-LNP区分开来。筛选可电离脂质库以找到最佳脂质，可增强表达并在mRNA-LNP疫苗中提供更好的免疫反应，同时保持低毒性的特征。可电离的脂质包括：(1)可电离的头部基团，(2)接头区域和(3)烃链（图2a）。虽然可电离脂质结构各不相同，但已经出现了一些用于mRNA-LNP疫苗的有效可电离脂质的共同基础。

图2   LNP 配方注意事项

mRNA-1273和BNT162b2疫苗各自包含不同的可电离脂质，但它们都含有一个氨基醇头基，pKa分别为6.75和6.09。Moderna的一项研究声称，在mRNA疫苗后引发适应性免疫反应的可电离脂质pKa的最佳范围是6.6-6.9，而6.2-6.6的pKa范围已被证明是IV递送后蛋白质表达的最佳范围。有趣的是，这与mRNA-1273可电离脂质的pKa一致，但与BNT162b2不一致。

接头区域将头部基团与脂烃尾部连接起来，也因其对RNA-LNP体内活性的影响而受到关注。目前假设接头区域有助于头部基团pKa和RNA-LNP内体逃逸潜力。对连接器区域优化的研究是一个持续的过程。已经设计并筛选了具有各种接头结构的可电离脂质文库，以了解它们更有效地递送RNA-LNP的能力。

此外，还应考虑可电离脂质的脂质尾部。脂质结构（以及因此的LNP结构）通过改变内体逃逸、储存期间的稳定性和毒性来影响表达效率。有趣的是，研究声称各种不饱和度和疏水尾的对称性与更有效和更稳定的LNP之间存在相关性。例如，支链烃类脂尾可能会产生更锥形的结构，从而增强内体逃逸。此外，酯键被引入脂质烃链以改善可电离脂质的药代动力学特性。FDA批准的第一个可电离脂质DLin-MC3-DMA(MC3)由于其给药后的较长组织半衰期而引起了一些关注。这推动了可生物降解的可电离脂质的发展，以改善脂质代谢并防止毒性。在烃尾和接头区域中引入一个或多个酯键，导致酯酶在体内裂解，从而改善脂质的药代动力学特性，并降低毒性。各项研究均在不断试图寻找链中的最佳酯键位置。假设将这些键放置得太靠近头部基团-接头区域会通过改变头部基团pKa降低整体LNP功效。因此，最好将它们定位在脂质尾部的更下游。目前，mRNA-1273和BNT162b2都含有带有可生物降解键的支链烃尾（图2b）。

聚乙二醇（PEG）脂类

聚乙二醇脂质提供胶体稳定性，防止蛋白质（卵磷脂）与纳米粒子结合，从而减少网状内皮系统（RES）对纳米粒子在系统循环中的清除，从而实现更长的系统循环 。PEG脂质较低的融合性能阻碍mRNA的内体释放。PEG脂质还可以通过防止LNPs在溶液中的物理聚集来提高其储存稳定性，否则LNPs的粒径就会增大，从而进一步导致封装的mRNA过早释放。

图3 脂质纳米颗粒（LNPs）的成分示意图

磷脂类

磷脂通常是中性的，如DSPC和DPPC，它们为LNPs提供双分子层结构的稳定性。它们还在LNPs的融合性和生物分布（降低毒性）方面发挥作用。DPPC是一种天然的肺部表面活性剂，是肺部剂型的首选脂质。通过将DSPC（另一种饱和磷脂，其脂质转化温度（Tm）明显高于55℃）与DPPC（Tm为41℃）相结合，可以改变封装的mRNA的释放特征。

图4 从脂质纳米颗粒（LNPs）内的脂质蛋白中释放治疗性mRNA的假设性细胞释放。pKa 阳离子可电离脂质的酸解常数

胆固醇

胆固醇是一种中性脂质，通过提高其硬度和防止治疗成分的泄漏来增强双分子层的稳定性。此外，当在最佳浓度中使用时，它被认为在LNPs的膜融合和基因转移中发挥作用。

（2）LNP制备

mRNA在低pH值的水缓冲液中制备，pH值~4.0，并与疏水性脂质的乙醇溶液进行微流体混合，形成低分散性的不稳定LNPs，其中含有25-50%的乙醇并且混合后的样品pH值低。LNPs需要立即使用切向流过滤（TFF）进行透析或缓冲液交换或浓缩，之后使用0.2 μm的无菌级过滤机进行无菌过滤，并装入无菌容器。完成后的药物产品可以是冻干的形式，也可以是直接的成品形式（图5）。

图5 脂质纳米颗粒（LNPs）的制造工艺流程及其相关的关键工艺参数和关键质量属性

传统的乙醇注射和薄膜水化方法被微流体混合装置所取代，因为微流体混合装置具有均匀的窄粒径分布和较高的包封效率。水相和乙醇相的初始混合产生pH 5.5的预体，质子化可电离脂质(pH < pKa)，这允许mRNA结合和封装。随后，TFF逐渐增加整体pH到中性，其中阳离子可电离脂质逐渐变得不带电且疏水性更强。从而促使小泡融合，并导致可电离的脂质与mRNA进一步隔离到固体脂质纳米颗粒内部。PEG -脂质含量通过为LNP提供亲水性外表面来阻止融合过程，而形成中性磷脂(如DSPC)的双分子层就存在于PEG -脂质层的下方。需要优化的各种配方参数是脂质浓度，脂质摩尔比，阳离子可电离脂质:mRNA比值(N/P比值)影响LNPs内mRNA的最大包封。不同的配方技术提供不同的包封效率和不同的颗粒大小，具有可变的PDI。LNPs的形态不像传统的脂质体（其特征是水核周围有脂质双分子层）。LNPs拥有一个电子密集的核心(如低温透射电镜所见)，在这个核心中，阳离子/可电离脂质被组织成倒转的胶束，围绕在被包裹的mRNA分子周围。LNPs是mRNA递送的首选载体，已成功用于各种临床配方，包括COVID-19 mRNA疫苗

3. 解决mRNA疫苗稳定性的严峻现实

（1）mRNA稳定性

完整的mRNA分子对其作为疫苗的效力至关重要。即使是轻微的降解反应，在mRNA链的任何地方，都会严重影响翻译，从而导致靶抗原的不完全表达。脂质（如脂质纳米颗粒，LNP）和蛋白质（鱼精蛋白，一种天然存在的碱性/阳离子聚合物）用于增强细胞内mRNA递送。配制的mRNA疫苗的这些关键成分调节mRNA在体内的分布，帮助mRNA分子进入细胞，并影响蛋白质抗原表达和免疫原性以及安全性。

此外，它们可能会影响储存过程中的mRNA稳定性。在一项理论研究中预测当mRNA掺入阳离子脂质制剂中时，mRNA的裂解速率会增加。基于这些考虑，这些赋形剂的性质、质量和供应商，以及配方制造工艺的设计，可能会影响配制mRNA候选疫苗的药物稳定性，包括mRNA的化学稳定性及其复合物的胶体稳定性。

（2）监管准则

2020年6月，FDA在“COVID-19疫苗开发和许可指南”中规定所有质量指示试验的资格/验证数据应提交BLA（生物制剂许可证申请）。对于疫苗许可，当保持在推荐的储存温度时，应使用至少三个由不同疫苗批次制成的最终批次的最终容器来证明疫苗在其最终容器中的稳定性和有效期。EMA将用于传染病的mRNA疫苗视为生物医药产品的药物。这些药物由人类医药产品委员会（CHMP）负责，并遵循集中程序通过EMA获得上市批准。这是临床试验申请（CTA）的一部分。IMPD包含有关mRNA分子本身以及降解产物（即产物杂质）和工艺杂质的信息。最后，要求提供关键mRNA产物稳定性参数的数据，其中mRNA组分的稳定性指示参数为：mRNA完整性，含量和效力以及药物特性，包括pH值，外观和药物产物的微生物状态。有关生物原料药和最终药物产品的规格和稳定性测试的详细信息。

（3）长期保存

mRNA-LNPs的长期储存和稳定性是制剂设计中的一个主要考虑因素，鉴于其高度的临床相关性和对疫苗分布以及最终价格的影响，尚未彻底探索这一点。Moderna的mRNA-1273的开发速度令人惊讶，这是第一个进入临床试验的SARS-CoV-2 mRNA疫苗。从第一个病毒基因组发表开始，仅用了两天时间就完成了疫苗序列，生产第一剂疫苗用了25天，直到第一个参与者在1期临床研究(NCT04283461)中接种了63天。然而，扩大规模以满足全球疫苗需求具有挑战性。由于室温下mRNA-LNP的不稳定性，目前批准的mRNA疫苗（BNT162b2为-80°C，mRNA-1273为-20°C）的超低储存要求是系统限制。为了找到最佳的LNP冷冻条件，已经进行了几项研究。目前，人们普遍认为，冷冻LNPs时，应在mRNA-LNP配制后添加冷冻保护剂，如蔗糖或海藻糖。目前，mRNA-1273和BNT162b在最终产品预稀释中都含有10%的最终蔗糖浓度。值得注意的是，虽然蔗糖目前在两种授权的COVID-19 mRNA疫苗中用作冷冻保护剂，但初始温度要求不同，Moderna的mRNA-1273储存在-15°C至-20°C，辉瑞/BioNTech的BNT162b2储存在-60°C至-80°C。

稳定性和长期储存对于 mRNA-LNP 制剂至关重要。根据杜克大学全球健康创新中心的分析，预计 2021 年计划生产 41 亿剂 mRNA-LNP 疫苗，请注意，今年整个 SARS-CoV-2 疫苗前景预计为 120 亿剂。在超低温下储存这些疫苗的要求具有挑战性。当前的一个假设声称，关键点是 LNP 内的 mRNA 链稳定性，而不是载体稳定性。因此，虽然 mRNA 结构和修饰的算法优化可以提高稳定性，但目前最好的疫苗应该用蔗糖等冷冻保护剂配制，并且仍然需要在非冷冻温度下保持 LNP 稳定性的新解决方案。

入文

输入文字

输

结论

有效的 mRNA-LNP 的成功设计包括需要根据治疗目的做出的多种考虑和选择。虽然成功的 mRNA-LNP 没有单一的配方，但在分析目前已知的成功 mRNA 疫苗时，确实出现了一些共同点。修饰核苷和mRNA序列优化是最大化的蛋白表达所必需的；至于LNP载体，目前批准的mRNA-LNP疫苗具有相似的脂质比例；稳定性和长期储存对于LNP制剂至关重要，蔗糖溶液常用作冻干稳定剂。

综上所述，mRNA-LNP 疫苗是一种有效的模块化疫苗平台，可以快速生产新疫苗，应根据治疗靶点进行优化设计。

入文

文献来源：1. Edo Kon et al. Principles for designing an optimal mRNA lipid nanoparticle vaccine. Current opinion in biotechnology. 2022, 73: 329-336.2. Ramachandran Sivakumar et al. Delivery Strategies for mRNA Vaccines. Pharmaceutical Medicine. 2022, 36: 11-20.3. Crommelin, D et al. Addressing the Cold Reality of mRNA Vaccine Stability. Journal of pharmaceutical sciences. 2021,110: 997–1001.

领域：抗体药物,核酸药物