2023-3-07 11:57
此前，我们分享了DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路（点击查看详情），进而鉴定出研究的目的基因或目标区域的DNA甲基化。
做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。
一、简单验证
目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）
DNA甲基化干扰：
DNA甲基化酶的敲降/敲除/过表达
DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。
检测整体DNA甲基化变化：
5mC甲基化免疫荧光染色（定性）
DNA斑点杂交（定性）
比色法（定量）
质谱法（定量）
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
目的基因DNA甲基化的干扰：
荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）：使用CpG甲基转移酶在体外将质粒进行甲基化，构建含甲基化/未甲基化启动子的目标基因-荧光素酶表达质粒。
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
检测细胞功能受到的影响:
免疫荧光显微观察
功能标志物测定
... ...
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）
靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。
超高深度：可达几百到几千乘。
单个区域长度<300bp
需要设计BS引物，进行预扩增实验。
WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR
关靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）
对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。
应用方向：
Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用
后续目标基因的甲基化验证
技术优势：
多基因多重扩增，检测通量高；
超高深度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测灵敏度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；
样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；
适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；
检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。
典型案例：
Target-BS用于甲基化多位点甲状腺结节诊断
Target-BS发现食管鳞癌甲基化 biomarker
领域：分子生物学
标签：DNA甲基化篇，实验验证方法，高通量测序
