新一代 LFA - 在 Unisart StructSure®膜上多重检测

Talena Jarling

SCIENION GmbH, Berlin, Germany

摘要

近年来，侧向流多重检测法已经在疾病管理中越来越受欢迎，因为可以同时快速分析多个参数或生物标志物。常见的侧向流检测格式是在同一测试条上包含多条检测线或捕获区，每条检测线或捕获区都用于检测特定的目标分子。这种连续线式检测存在一些限制，包括假阴性、交叉反应或高抗体消耗。在这篇白皮书中，展示了一个完整的解决方案，包括使用结构化膜进行检测开发、卡壳使用和先进的测向流检测读值，这些都在一个用于检测脓毒症生物标记物C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)的多重侧向流检测中得到展示。利用

SCIENION GmbH公司的点样技术，结合赛多利斯公司独特结构的 Unisart StructSure® 膜分离技术，实现了检测线到检测点的微型化，与使用传统的横向流动检测线相比，提高了检测性能和可靠性。

简介

在卫生保健的动态环境中，对快速准确的诊断工具的需求从未像现在这样迫切。COVID-19 大流行就是一个鲜明的例子，它彻底改变了人们对POCT的认识，并凸显了其优势。测向流动免疫测定（LFA）成本低，便于携带，无需处理试剂，未经培训的人员也能简单使用，因此作为诊断测试特别受欢迎。然而，与常用的单联试剂条相比，LFA的潜力更大。

疾病治疗需要准确的诊断、及时的决策和有效的患者管理。然而，由于一些疾病的症状重叠、单个标记物的特异性不足或分析物水平显示的疾病严重程度不同，有些疾病需要分析多种生物标记物或分析物水平。因此，多参数诊断检测允许同时分析多种因素，并通过单个测试提供对各种健康状况的监测。

一些商业化的LFA通过在试条上应用多个测试线来组合生物标记物，从而提高了提高诊断的精确性和效率（图 1 B，左侧面板）。然而，这种方法涉及到消耗大量抗体来进行免疫反应，同时还存在信号相互依赖、假阴性和检测线间检测器消耗的高风险。本白皮书介绍了一种方法，通过使用赛多利斯公司独特的结构膜 Unisart StructSure® 实现从线到点的微型化和独立性，从而避免上述所有问题。

敬请期待下一代LFA多重检测的进展。

背景介绍点阵型LFA的优势

点阵型LFA在LFA市场领域是一种新型技术，为多路复用和/或定量分析与自动读取结合开辟了新的可能性。通过减少固定在固相上的捕获抗体用量，可在信号强度相同的情况下节省大量捕获分子。通常的5毫米LFA条带由一条含有约1µl/cm

的1mg/ml捕获抗体的线组成[Parolo等人(2020)]。通过使用3x10纳升的点样量（总共30纳升）替代这条线,可以减少约95％的昂贵抗体的用量和成本，同时保持相同的灵敏度。对于价格为200欧元/毫克的常规a-鼠IgG来说，这意味着在SCIENION的sciFLEXARRAYER S100精密点样系统每年高通量生产200万根试纸的情况下，节省了19万欧元的成本。此外，通过在一个测试中进行多次测定，可以确保更好的准确性和可靠性。

与多重检测线相比，使用点来捕获分子的另一个主要优势是降低了假阴性信号的风险。如果在LFA 中使用颗粒结合的检测抗体，由于分析物、捕获抗体和检测颗粒的复合物堵塞了膜孔，第一条线会在运行方向上可能会产生膜壁。因此，由于遮挡效应，信号会随着前几条线的增加而减弱。通过分配≤ 5纳升的点（图1A）可以消除这种效应,从而在同一条测试线路内组合各种生物标志物，并自由设计点的排列方式。如果所需的灵敏度需要更大的点样体积以增加所呈现的捕获抗体的数量，还可以通过在每个点的个别线路上灵活布置点来避免假阴性信号（图1）。

图1: 点阵型LFA的灵活布置点的示意图。

图1：基于点的LFA的优势：由于风影效应，沿着侧向流动方向，每个点（体积>5纳升，红色圆圈）的强度逐渐减小。B 线性和点状多重试验的比较（左侧为线性格式，右侧为点状格式）：沿着侧向流动方向，线和点的强度逐渐减小，在一个通道中依次排列（连续的点），而一个通道只有一个点则保持恒定的强度。C 使用Epson Perfection V600对B进行定量读取。灰度强度描述了在ImageJ中分析的8位图像的像素值，绝对值是根据峰值下面积（AuP）确定的，与背景有所区别。

Unisart StructSure®膜的优势

样品流体的流动动态对 LFA 的效果起着至关重要的作用，影响着分析物和抗体在系统内的传输和相互作用。Unisart StructSure®膜提供了一种特定的流动模式,直接影响LFA的性能。根据Young-Laplace方程[Olanrewaju等人(2018)]，毛细力与通道宽度呈反比关系。作为LFA的驱动力，较窄的通道会增加了样品的流动性，需要更少的样品体积来达到相同的流动距离。这在处理有限样品量时非常有优势，使该测定方法更适用于稀缺样品的应用。此外，更大的驱动力导致流速增加，使分析物-检测物-混合物更早到达捕获抗体。将Unisart StructSure®膜与相同类型的常规非结构化Unisart膜（CN140）和相同宽度进行直接比较，水和血清通过膜的时间分别缩短了48%和35%，从而改善了粘性溶液的流动性。

此外，如Unisart StructSure®膜所示，将通道宽度从14毫米减小到每个通道宽度为2毫米的6个通道，可以促进层流流动，因为雷诺数（Re）是预测流动状态的参数，随着特征长度（在本例中为通道宽度）的减小而减小，表明雷诺数较低时出现层流流动。这种流体流动的特点是平滑而有序的流体层平行移动，提供了更可预测和可重现的流动曲线，这对于设计精确和可控的实验至关重要。层流流动减少了分散，使得检测成分的相互作用更加局部化和可控化。【Kenis, et al. (2000)】此外，通过样品与检测试剂的受控混合，能促进更有效的相互作用，从而增加灵敏度。为了实现这种混合，通过曲线形状产生湍流，因为样品的不同部分在曲线内的通道外部区域附近承受的压力会增加，因此速度变化，导致了分析物的扩散（图）【Krzyk, et al. (2018)】。流体内增强的物质聚集使得分析物与检测器和捕获抗体接触，从而改善了结合。层流流动和湍流的受控产生的结合导致有益的流体动力学，而过度的分散可能会影响检测的准确性。

图2：Unisart StructSure®膜的流体动力学。窄通道在直线段提供层流流动，而在弯曲处由于速度变化而产生湍流。内壁上的流速比外壁上的流速减小，导致流体重叠和旋涡。

波状结构的另一个特点是从普通膜的25毫米延伸到Unisart StructSure®膜的26.2毫米的吸收垫距离，为捕获分子提供更大的距离，从而在分析物和探测器之间提供更长的孵育时间。根据实验要求，这种延伸可以提供更灵活的实验布局。

案例研究- 多重脓毒症快速诊断试纸Case study

多重脓毒症是一种危及生命的疾病，当机体对感染的反应失调时，会导致全身性炎症和器官功能障碍。及早准确的诊断对于及时干预和改善患者预后至关重要。目前用于多重脓毒症诊断的最常用生物标志物是降钙素原（PCT）C反应蛋白（CRP），前者通常保持在较低的血液浓度，但在细菌感染（尤其是多重脓毒症）时会显著升高，后者则是一般的炎症标志物。由于CRP是一种敏感的标志物，但对于脓毒症不具有特异性，而PCT是一种特异性较高但敏感性较低的标志物，二者的结合可达到平衡，改善多重脓毒症诊断的敏感性和特异性。此外，PCT确保早期发现脓毒症，并区分细菌性和非细菌性炎症，从而提供更准确和有针对性的治疗决策。测量PCT和CRP的浓度可以提供关于脓毒症严重程度的信息,有助于急性患者的管理和监测。

表1: 用于检测脓毒症的生物标志物，以血液浓度作为分界值。

借助它们互补的优势，本白皮书提出的方法用于建立一种多重免疫层析法(multiplex LFA)，将PCT和CRP分别以三个浓度作为不同严重程度的脓毒症的分界值(表1)。通过评估斑点的存在/不存在以及相应的分界值，可以通过肉眼进行半定量评估，但也可以通过使用sciREADER LF2 (SCIENION GmbH, 图9)与集成的动力学测量算法进行定量评估。

材料与方法

使用SCIENION的sciFLEXARRAYER SX

（图4）精密微量点样仪,在Unisart CN 140 

StructSure®(赛多利斯, 

3UN14ER066S01WS）上打印多重阵列。简而言之，按照图 5 所示的检测布局预埋10纳升三种不同浓度的抗PCT和抗CRP抗体（HyTest）。第二种抗PCT和抗CRP抗体与碳纳米颗粒结合,以夹心测定的形式检测分析物PCT和CRP。

由于配备了两个高分辨率摄像头（图4，水平摄像头和垂直摄像头）,sciFLEXARRAYER系统可以完全控制液滴的生成，从而验证喷点的质量。通过将特定目标靶标成像为参考点，如同Unisart StructSure®膜（图3）所示，能够补偿目标位置和方向的变化。通过水平摄像头监测液滴的生成、液滴体积、质量以及与轴定位的偏差，显示出纳米级的稳定液滴（图 4、5）。在喷点过程结束时，垂直摄像头可对目标进行检测，只有斑点符合特定质量标准的膜才能通过检测。

图3:

以特定基准点为参考，通过正确的目标位置和方向进行精确定点。

大卡是通过使用一张背板（Kenosha牌）、印刷膜、吸收垫（Whatman CF5，Cytiva品牌）以及样品应用垫（玻璃纤维，Kenosha牌）组装而成的。之后,使用剪切机（Matrix 2360剪切机，Kinematic Automation公司）将卡片切割成14毫米宽的条形,确保每个膜结构的完整性。将膜条放入由Sartorius和SCIENION GmbH 合作开发的完美贴合的卡壳中，然后涂上结合物和样品的混合物,进行试运行。孵育30分钟后, 使用带有集成分析软件的sciREADER CL2（SCIENION GmbH公司）对条形进行测量和分析。

sciFLEXARRAYER SX（SCIENION）是一种精密微量点样仪，用于在Unisart CN 140 StructSure®膜上预埋抗体。箭头和数字表示以下内容的存在:（i）压电式点样毛细管；（ii）用于点样后对膜成像的垂直相机;（iii）用于可视化和量化滴液参数的高分辨率水平滴液相机;（iv）膜的靶标支架;（v）96孔板的位置，其中包含待点样的抗体;（vi）控制sciFLEXARRAYER SX微量点样仪的软件的计算机屏幕。

结果与讨论（提出的解决方案）结构化膜与精密微量点样仪技术相结合可提高性能可以通过眼睛进行评估

在任何类型的膜上都可以在LFA上进行基于点的多重检测。由于该检测的复杂性，通过眼睛来评估图案可能具有挑战性，因此建议使用读取器进行分析。由于Sartorius Unisart StructSure®膜的结构设计，可以将视觉点与相应的生物标志物相对应，简化评估过程而无需读取器。在已建立的脓毒症多重检测实验中，即使不是所有的点都出现，也可以很容易区分膜结构左侧三个通道中CRP的三个点和右侧PCT的点（图5）,从而确保半定量分析和对感染严重程度和类型（细菌性、非细菌性）的决策。小通道可更好地控制检测区域内不同的捕获分子的位置。然而,由于点的大小,决定点存在与否仍然是主观的,因此使用读取器是有意义的。这种可指定的定位需要高精度的喷点，而 SCIENION的sciDROP PICO 点样技术可以实现这一点。非接触式点样可确保膜的完整性,从而产生具有可控液滴量的均匀斑点,实现最佳的检测性能。

图5：Unisart StructSure®膜上的脓毒症多重检测：通过在截断区域的相应斑点的存在/缺失进行半定量评估。1：鼠IgG，检测对照;2：10 µg/ml CRP的临界值（低）;3：40 µg/ml CRP的临界值（中）;4：200 µg/ml CRP的临界值（高）;5：0.5 ng/ml PCT的临界值（低）;6：2 ng/ml PCT的临界值（中）;7：10 ng/ml PCT的临界值（高）。

信号强度增强

如前所诉,由于反应区域扩大，结构化膜提供了有利的流动动态，并延长了分析物与抗体之间的孵育时间。与同批次的非结构化Unisart® CN140膜相比，结构化膜的信号强度增加了 52%，这与斑点位置有关（图6）。

图6:Unisart StructSure®与非结构化膜的比较。A:非结构膜（左图）和 Unisart StructSure® 膜（右图）上 10 纳克/毫升 PCT 样品斑点的半定量评估。蓝色矩形内的斑点用于B：Unisart StructSure®和非结构化膜上0.5、2、10ng/ml PCT斑点强度的比较。

特定的卡壳装置提高了检测的可重复性并缩短了时间

专为Unisart StructSure®膜条尺寸设计的样品盒支持流体动力学特性（图7A）。通过确保材料之间的均匀过渡，卡壳装置保证了所有通道中的控制和均匀流动，从而确保更高的重现性。这一点在信号强度尚未完全形成的孵育时间内表现得尤为明显，使用卡壳装置而非松散的检测棒孵育30分钟后，脓毒症多重LFA的CV值减少了10%（图7 B）。因此，这种用于日常实验室或家庭使用的即时检测可以在较短的时间内完成，而无需等待信号完全形成（此处为60分钟）。

图7：使用LFA盒改善流体动力学。（A）14毫米Unisart StructSure®和常规Unisart® LFA试剂盒的图片，由Scienion GmbH和赛多利斯公司合作设计和制作。（B）与无卡壳情况下，30分钟和60分钟孵育后控制点信号变异系数（CV）的比较。每个变种测试了包括6个控制点的16个试纸条。

同时检测丰度差异极大的分析物

除了已知的Sartorius Unisart®膜的质量外，Unisart StructSure®膜的特性还允许在一根膜条上同时检测浓度相差4-5个数量的丰度差异很大的分析物。当将具有大量丰度差异的生物标志物结合在所需测量范围内时，提高一个生物标志物的灵敏度同时降低另一个生物标志物的灵敏度可能具有挑战性，因为大多数检测成分（如样品缓冲液、样品体积、样品稀释、固相材料和流体动力学）直接影响两种检测方法。通过添加与过量CRP分析物竞争结合的非标记抗CRP抗体，可以显著降低CRP实验的灵敏度，而不会影响PCT检测所需的灵敏度。通过改变各自的捕获抗体浓度，可以区分ng/ml范围内的PCT浓度，同时检测ng/ml浓度的CRP（图8）。

图8：调整捕获抗体浓度以达到所需的灵敏度

A：在不同的CRP分析物浓度下，根据CRP捕获抗体浓度和PCT分析物浓度的变化曲线，在临界点的低、中、高三个位置进行滴度测定。

B：在不同的捕获抗体值下，可以区分CRP和PCT的临界点。

注：CRP为C-反应蛋白，PCT为降钙素原。利用SCIENION的芯片扫描仪技术进行定量分析图 9：用于LFA检测定量读数的sciREADER LF2

使用Unisart

StructSure®膜可以对CRP和PCT临界值进行半定量评估，但使用 SCIENION 的扫描仪技术可以更容易地区分临界值上是否存在斑点。sciREADER LF2是一种便携式扫描仪设备，专为 LFA 的动力学和终点分析而设计，尤其适用于分析由多个检测器区域组成的斑点阵列，其强大的网格排列和斑点查找算法确保了分析的准确性。用于检测高表达血液标志物（如CRP）的夹心免疫测定通常受到钩状效应的限制。通过实时测量测试点和对照点的信号强度，可观察到测试与对照比率（T/C）的变化，表明低浓度和极高浓度分析物的信号发展速度不同，而终点测量时的最终 T/C 值可能相同[Rey等（2017）]。这使得通过动力学测量来扩展LFA的动态范围成为可能。

此外,动力学还能在早期阶段识别反应,一旦检测到临界值，可以立即停止测量,从而减少测定时间。由于信号强度的发展速率与夹心式或竞争性测定中的分析物浓度成正比或反比，因此可以使用不同测量点之间的斜率并参照预先确定的标准曲线进行定量测定，该标准曲线可以在读取程序中定义为参考。这样,每次测试时就无需携带单独的标准物质即可进行定量测定。

每通道检测一个结合物，提高特异性

在全贴试剂盒中，结合物通常被分散并干燥到适合样品溶解的垫上。在多重检测法中，有多种方法可以将检测抗体整合到一起，例如同时结合、单独结合抗体的混合，同时将所有检测器固定在释放垫上，或者将单个结合物在垫上进行空间分离。无论如何，在运行过程中，样品-结合物混合物一起流过膜时，检测抗体会混合在一起，从而存在交叉污染和非特异性的风险。Unisart StructSure®膜的细分现在提供了全面分离相应检测物的新可能性，避免了非关键反应抗体之间的接触，从而提高了特异性。初步实验结果表明，将结合物直接应用到经过预封闭的结构化膜的一个通道中时，可以获得有希望的结果，以避免膜与结合物之间的结合。此外，分隔的通道可在某些通道中放置疏水性障碍，以实现不同的反应时间，以支持相应生物标记物-抗体动力学，并满足检测不同浓度范围的生物标记物的要求。目前正在研究结合物从膜上溶解的能力和相关的检测功能，以及通过对膜进行疏水性处理来改进对不同丰度生物标记物的同时检测。

致谢

作者衷心感谢未来诊断公司作为合作伙伴，在研发案例研究检测方面进行发明、创造和验证体外诊断产品的合作。

领域：细胞生物学,分子生物学,蛋白/抗体/蛋白质组

标签：scienion;微量喷点;高通量