肿瘤早期预警的血清多肽谱的临床样品标准血清的制备、保存和纯化

1. 被检查者的基本资料的收集： 1.1 被检查者的基本信息，包括年龄、性别、身高、体重、职业、民族、饮食习惯等。 1.2 被检查者的家族的遗传史，以往的患病与治疗史，过敏等情况。 1.3 被检查者的临床表现，包括各种体症的表现，如发烧，疼痛等。 1.4 被检查者的临床影像学的表现，如核磁、CT和PET等。 1.5 被检查者的病理切片、活检结果、细胞学观察、肿瘤标志物的检测结果等临床其它的检测结果。

2. 血清的制备和保存： 2.1 被检查者早上禁食，上午抽血。 2.2 采用10-20ml的一次性注射器从被检查者的上臂的静脉血管抽出5ml血液，抽出后，放入10ml的聚丙烯的塑料管，水平静置，室温30分钟（室温为25℃）。 2.3 在角转头小型离心机中于1400g，室温，离心10分钟。 2.4 取出上面的血清，避免取出下层的血浆，将血清分装成100微升每小管，置于200μl的聚丙烯的塑料管中。 2.5 将装有血清的200μl的聚丙烯的塑料管立即保存于-80℃。可保存6个月。

3. 运用磁珠对血清进行纯化： 3.1  彻底涡旋混匀磁珠至少1min，以获得均一的磁珠混悬液。 3.2  将10μl结合液和5μl样品（如人血清）（含有的蛋白最多为500pmol）  转移入一个标准的薄壁聚丙烯PCR管中。加入5μl混匀的磁珠，上下吹吸5次，小心混合液体。等待1min。 3.3  将PCR管置于一个磁隔离器（magnetic bead separator，MBS）内，等待20sec，以将磁珠从上清液中分离。注意管内磁珠的运动。 3.4  用移液器小心移去上清。避免枪头和磁珠接触，小心不要移动磁珠。 3.5  将PCR管从磁隔离器中转移出来。 3.6  为了洗涤，加入100μl洗液。 3.7  将PCR管放入磁隔离器内，将管在临近孔之间来回移动20次，以洗涤磁珠。 3.8  等待20sec以聚集磁珠于管壁上，用枪小心移去上清。 3.9  重复步骤6-8两次。 3.10 在磁珠中，加入5μl乙腈（50%），彻底混匀。等待1min。（小心：乙腈  是易挥发性的，可快速蒸发！）。 3.11 将管放置在磁隔离器内，等待30sec以将磁珠从洗脱液中分离出来，而存留在管壁上。 2.12  最后，将含有纯化的多肽/蛋白质的洗脱液转移到一个新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中。

4．纯化后血清样品的质谱分析 4.1 取1μl洗脱液加入新的0.2ml薄壁聚丙烯PCR管中，加入10μl基质，混匀，加1μl在Anchorchip靶板上，在空气中干燥，约5-10分钟。 4.2 按说明书对质谱仪调整参数，用外标进行校正，然后对样品进行分析。 4.3 软件获取数据，处理，得到每个样品的质谱图。 4.4 软件分析，建立疾病组和正常对照组的标准谱图，并根据差异的蛋白峰建立疾病组的特征血清多肽谱。

5．未知样品的盲性测试 5.1 取临床高危或普查的人群的血清，按上述方法进行资料的收集，血清的采集、保存、纯化和质谱分析。 5.2 软件分析与统计，决定其归属疾病或健康。 5.3 与临床金标准如病理、细胞学等进行比较。 5.4 根据统计结果，确定未知样品的盲性测试准确率。

 

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