如何制备核酸脂质纳米粒（LNP）？

2022-07-20 00:13铭汰医药设备(上海)有限公司

mRNA疫苗的上市，不仅有效的缓解了疫情，更是打开了LNP研究领域的大门。越来越多的研究表明，LNP在基因编辑、肿瘤治疗等诸多方面存在着巨大的潜力。而对于想进入此领域的研究者来说，最关心的问题莫过于如何制备LNP？

1.原料准备

铭汰公司的微流控设备可以用来合成LNP。在合成之前，只需要准备好适当的原料。原料分为两部分：水相和有机相，水相里面包含缓冲液和核酸，如柠檬酸钠缓冲液和mRNA。有机相为各种脂质的混合物，实际上，多为四种类型的脂质混合物：阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG脂质。图1展示了多种LNP药品的真实配方，四种脂质的摩尔占比也有呈现，对于刚进入LNP领域的研究者来说，有着很好的参考价值。

图1. 三种mRNA-LNP药品信息

2.N、P比计算

使用微流控设备合成样品时，需要进行配方参数的设定，其中流速比的设定非常关键。流速比可以理解为水相和有机相的消耗量之比，那么设定为多少最为合适呢，这里我们就要先引入一个概念，叫做N、P比。

图2.LNP模型图

核酸分子具有大量磷酸根（P），显负电；阳离子脂质具有可电离铵根(N)，显正电。两者可通过静电吸附的方式结合在一起，不合理的比例可能会导致粒径过大、稳定性差等缺陷。所以流速比的设定，主要是为了满足合适的N、P比。

N、P比的计算也较为简单：假设已知水相：有机相流速为3：1，N的物质的量=阳离子脂质摩尔浓度×1份体积（阳离子脂质仅含单个可电离铵根），P的物质的量=单核苷酸的近似摩尔浓度×3份体积，二者物质的量之比即为N、P比。

从图1中也可以看到，较为常用的N、P比为6，当然，此数值并不固定，可根据具体实验进行灵活调控。了解了N、P比的计算，我们也就不难知道：确定N、P比之后，水相和有机相的浓度决定了微流控设备上流速比的设定；也可以先确定N、P比和流速比，进而确定两相的浓度。

3.后处理

假设在合成LNP时，流速比设为3：1，那么在合成之后，样品中有机相体积占比为25%。高浓度的有机相会破坏纳米粒子的结构，影响后续实验的进行，因此，对合成的样品进行及时后处理就很有必要。

① 稀释。建议将合成的样品用去钙去镁的D-PBS稀释40倍，稀释后可取1mL左右进行粒径测定，剩余样品执行后续处理。

② 超滤或透析。将样品通过超滤或透析的方式去除溶剂，可浓缩为接近稀释前的体积。

③ 除菌。浓缩后的液体过0.2μm的滤膜进行除菌，此步骤可在生物安全柜中进行。

完成以上步骤后，即得到最终成品，可根据使用者的实际需求稀释成相应浓度，进行后续的动物或细胞实验。

看完以上的介绍，相信大家对LNP的制备已经有所了解。与合成环节相比，原料准备与后处理过程同样重要。铭汰公司的纳米药物递送平台不仅提供了全系列的优质设备，同时也提供高质量的数据分析与技术支持服务，为LNP的制备及领域内应用起到真正的助力作用。

参考文献：

1.Schoenmaker L, Witzigmann D, Kulkarni JA, Verbeke R, Kersten G, Jiskoot W, Crommelin DJA. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. Int J Pharm. 2021 May 15;601:120586. doi: 10.1016/j.ijpharm.2021.120586. Epub 2021 Apr 9. PMID: 33839230; PMCID: PMC8032477.

2. Pilkington EH, Suys EJA, Trevaskis NL, Wheatley AK, Zukancic D, Algarni A, Al-Wassiti H, Davis TP, Pouton CW, Kent SJ, Truong NP. From influenza to COVID-19: Lipid nanoparticle mRNA vaccines at the frontiers of infectious diseases. Acta Biomater. 2021 Sep 1;131:16-40. doi: 10.1016/j.actbio.2021.06.023. Epub 2021 Jun 18. PMID: 34153512; PMCID: PMC8272596.

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