Oligo赛道想超车，纯化干燥工艺如何选择？

2023-05-24 17:05德祥科技有限公司

众所周知，随着寡核苷酸的应用越来越广泛，不少企业相继加入寡核苷酸合成的赛道。想得到优质高纯度的核酸不是一件简单的事，寡核苷酸的合成通常会导致不可避免的杂质积累，它们可能会与全长产品竞争，或者抑制反应，因此选择高效率高质量的纯化和干燥工艺是很有必要的。那么对于工业级别的寡核苷酸纯化，一般又有哪些方法呢？且听小编跟您慢慢分享。

寡核苷酸的应用

Oligo即寡核苷酸链，分子实验室常用的PCR引物、NGS捕获探针、qPCR探针和FISH探针等都是寡核苷酸。除了引物探针以外，还可作为核酸药物用于遗传疾病、肿瘤、病毒感染和感觉器官等疾病的治疗或预防。

探针及引物主要用于IVD试剂盒，面对需求量巨大的检测试剂盒，上游原材料的质量和供应速度应该同幅度进步和增长，在引物和探针的制备过程中，提高生产效率以及产物纯度更是重中之重。

纯化方式

对于不同的寡核苷酸链，应该如何选择合适的纯化方法？下面列举了几种常见的纯化方法。

DSL（脱盐）纯化

利用反相C-18层析柱进行脱盐，它对DNA有特异性的吸附，一些杂质，如氨、盐，不能被吸附，所以能有效地去除盐分等杂质。该方法不能有效去除比目的DNA短的小片段，所以适用于要求较低的PCR普通引物。

图1：DSL纯化制备流程图

OPC纯化

根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。该方法得到目的DNA的纯度能达到95%以上,但受柱容量影响，适用于40mer以下的普通引物。

图2：OPC纯化制备流程图

PAGE纯化聚彬稀酰胺凝胶电泳

使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链(大于50mer)普通引物的纯化特别有效。

图3：PAGE纯化制备流程图

HPLC高效液相色谱法

根据寡核苷酸的疏水性对DNA片段进行纯化分离，该方法能达到极高的纯度和灵敏度，可以有效去除N-1短片段，目标DHA的纯度大于95%。适用于对纯度要求高的短链（小于40mer）普通引物、修饰引物，尤其适合及荧光标记探针的纯化。

若想得到纯度极高的寡核苷酸片段，HPLC法也常被用于与其他方式双重联合（如HPLC_PAGE、HPLC_CE、2xHPLC等）。

图4：HPLC纯化制备流程图

引物干燥过程中的质量控制考虑

引物合成纯化后都会产生一定的有机溶剂（如乙腈、甲醇、水等），需要采用真空离心浓缩设备将寡核苷酸干燥成干粉状，一般包装至EP管或者96孔板中。

图5：引物生产流程

作为分子诊断qPCR试剂盒中的核心原料，qPCR引物及Taqman探针的质量直接影响了靶标检测的准确性，所以选择干燥工艺也十分关键，在干燥过程的质量控制需尽考虑以下几个方面：

样品保护和温度控制

在寡核苷酸的干燥过程中，尽量避免加热源直接照射在样品上而导致样品局部过热。红外加热模式，不直接加热样品，这样确保了样品的温度不会高于样品支架的温度，保证了样品的安全。SampleShield温度控制系统，采用非接触式温度探测用以在整个离心过程中，检测样品和离心腔的温度变化，确保整个蒸发过程受到质控。