肠道微生物与人类健康和疾病状态密切相关。肠道微生物的代谢系统非常庞大，但这些菌群相关通路对人体健康的影响却知之甚少。人类微生物组学研究通过检测健康或疾病个体，确定与表型相关的微生物组特征。目前研究发现，相比正常人，运动员体内含有独特的微生物组成，表现为Veillonellaceae，Bacteroides，Prevotella，Methanobrevibacter或Akkermansia丰度的增加，由此表明运动与微生物组组成有关，尽管这些微生物对表型的影响仍然未知。哈佛医学院George M. Church团队通过16S测序、宏基因组及代谢组学等技术对粪便和肠道内容物以及小鼠模型进行研究确定Veillonella菌属成员与运动之间的关系，相关成果发表于《Nature Medicine》。
粪便16S测序分析显示Veillonella丰度增加
为了确定与运动表型相关的肠道菌群，本研究招募了参加2015年波士顿马拉松赛的运动员15名（n = 15），以久坐不运动人群作为对照（n = 10），分别在马拉松前后5天收集每日粪便样本（运动前后时间标记为-5到+5， sample=209）进行16S rDNA测序。结果显示Veillonella菌属是运动前后差异最显著的特征菌属（Fig.1a，1b）。
为了证实Veillonella与马拉松运动员之间的关联，通过构建广义线性混合效应模型（GLMM）预测马拉松运动员Veillonella的相对丰度（Fig.1c），并计算GLMM中所有系数的显著性（Fig.1d），结果表明运动天数是唯一显著的变量，其他系数均不显著。此外，Veillonella在跑步者中比非跑步者更为普遍，虽然没有统计学差异。这些相关性提示Veillonella与马拉松运动员表现之间是否存在因果关系，但没有验证就不能得出上述结论。
V.atypica灌注改善小鼠运动耐力
为了评估动物运动实验中Veillonella是否可以提高小鼠运动耐力，于是设计了一个为期2周的AB / BA交叉实验，对照组（Lactobacillus bulgaricus灌注; n = 16）和处理组（ Veillonella atypica灌注; n = 16）一周后进行处理/对照交叉（总共n = 32只小鼠）。选择L. bulgaricus作为对照是因为它不能分解乳酸，可以模拟细菌负荷同时不影响乳酸代谢。Veillonella atypica菌株是直接从马拉松运动员分离获得的。给小鼠灌注V.atypica或L.bulgaricus并在5小时左右运动至体力耗尽，结果显示V.atypica灌注小鼠的最大运动时间显著长于L.bulgaricus灌注小鼠（Fig.2a），每个小鼠的运动时间均未发生GLMM过拟合；与对照组相比， V.atypica灌注小鼠平均运动时间增加13％（Fig.2a）。构建GLMM模型并分析GLMM中所有系数与运动时间的关系，结果显示，处理天数和Veillonella处理是显著的，序列效应不显著（Fig.2b）。测定运动后的炎症因子水平发现，与L.bulgaricus处理或磷酸缓冲盐溶液（PBS）处理相比，Veillonella灌注小鼠细胞炎症因子水平显著降低。Western blot检测葡萄糖转运体GLUT4的含量评估肌肉生理学的变化，各组间无明显变化。
作者选取两个独立队列（超级马拉松和奥运选拔赛赛艇运动员）运动前后的粪便样本（n = 87）进行宏基因组分析，，结果表明运动后Veillonella菌属发生显著增加，与16S测序结果一致。
甲基丙二酰辅酶A通路显著富集
利用新算法构建87个样本对应基因（n = 2,288,155）的相对丰度矩阵来研究数百万微生物基因对运动员的表型调节作用，在马拉松和划船队列中，将乳酸代谢为丙酸盐的甲基丙二酰辅酶A通路发生显著富集，且该通路的每个基因相对丰度都显著升高（Fig.3a）。鉴于甲基丙二酰辅酶A通路并非存在于所有微生物体内，这种运动后的富集变化提示Veillonella可能引起肠道微生物组代谢功能发生改变。从运动员中分离获得三种Veillonella菌株（(V. parvula, V. dispar 和 V. atypica），在补充乳酸的脑心浸液培养基（BHIL）和半合成乳酸培养基中进行培养，质谱分析结果发现培养基中出现大量乙酸盐和丙酸盐（Fig.4a）。
Veillonella菌种通过甲基丙二酰辅酶A通路将乳酸代谢成短链脂肪酸（SCFAs）---乙酸盐和丙酸盐。乳酸代谢第一步的酶--乳酸脱氢酶是，来自于系统发育不同的菌群（Fig.3b）。通过NCBI查询微生物基因组注释发现，与V. atypica不同，其他菌群理论上能够通过乳酸脱氢酶利用乳酸，但不具备将乳酸转化为丙酸盐的完整途径（Fig.3c）。其他专性厌氧菌，Anaerostipes caccae和Eubacterium hallii，通过不同的通路将乳酸发酵成丁酸盐（Fig.3c）。E. hallii还可以产生丙酸盐，但主要通过1,2-丙二醇的生物转化，而不是经历从乳酸到丙酸盐的完整途径。
总之，运动员运动后不仅Veillonella菌属显著增加，而且Veillonella菌种的乳酸代谢通路也发生显著富集，该结果提示运动期间肌肉产生的乳酸进入胃肠道并被Veillonella代谢。
乳酸穿过肠道屏障进入肠腔
作者进一步探讨乳酸能否可以穿过上皮屏障进入肠腔？尾静脉注射13C标记的乳酸钠到V. atypica或L.bulgaricus定植小鼠，12分钟后处死。选择该时间点是因为预实验中该时间点是尾静脉注射后血清乳酸水平恢复至基线水平的最早时间。采用心脏穿刺方法收集血清和血浆，并收集结肠和盲肠内容物。LC-MS分析结果表明血清、血浆、结肠内容物和盲肠内容物中均出现13C标记的乳酸（Fig.4b-d），但这些样本中并未检测到13C标记的丙酸盐，由此推测从尾静脉注射到12分钟后处死可能没有足够的时间使13C标记的乳酸穿过肠道屏障被肠道菌群代谢成丙酸盐。既然血清中乳酸能够进入肠腔，那么Veillonella定植否可以作为代谢池来限制血液中乳酸水平？为了检测Veillonella在体内加速血液乳酸清除的能力， V. atypica或L. bulgaricus定植小鼠进行腹腔注射乳酸钠并监测血液乳酸水平变化，结果显示处理组与对照组间的乳酸水平均无显著差异。尽管乳酸可以渗入肠腔，但绝大多数乳酸代谢发生在肝脏中，Veillonella灌注后未观察到乳酸清除率的改变。
直肠滴注丙酸盐改善小鼠运动耐力
丙酸盐已被证明可以增加心率和最大耗氧率，并影响小鼠的血压，提高禁食人群的静息能量消耗和脂质氧化。为了验证Veillonella的运动增强效应是否归因于丙酸盐，在小鼠跑步机模型中进行丙酸盐直肠内滴注。采用直肠滴注丙酸盐而非口服给予，因为直肠吸收可以使丙酸盐快速进入体循环，直观反映了源自Veillonella的丙酸盐的位置。与对照组生理盐水（n = 8）相比，丙酸盐滴注（n = 8）导致跑步机运行时间增加，与V. atypica灌胃结果一致（Fig.4e）。运动40分钟后测定细胞炎症因子水平，结果发现并无显著差异，在直肠中滴注丙酸盐可以促进运动增强且不影响所测细胞炎症因子水平。
小结
本研究首先确定了Veillonella与运动表型的关系，运动员进行马拉松后Veillonella相对丰度显著增加，从运动员粪便中分离出Veillonella atypica菌种,并移植小鼠体内后，小鼠运动时间明显增加。元基因组鸟枪测序分析发现，运动后，乳酸代谢到丙酸盐的主要途径中的每个基因都具有较高的相对丰度，甲基丙二酰辅酶A通路过表达。13C标记的乳酸盐体内实验阐明血清乳酸盐可通过上皮屏障进入肠道腔，直肠内滴注丙酸盐重现V. atypica灌胃后运动时间增加的表型。综上研究表明，V. atypica将运动诱导的乳酸转化为丙酸，从而改善运动时间，确定了一个自然的、微生物编码的酶促过程，从而提高运动成绩。
参考文献
Scheiman J et al., Meta-omics analysis of elite athletes identifies a performance-enhancing microbe that functions via lactate metabolism. Nat Med. 2019 doi: 10.1038/s41591-019-0485-4.
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