摘要：乳制品中主要含有哪些活性乳蛋白？如何分析这些乳蛋白？默克分析化学专家约稿火热开启。
引言：
乳及乳制品已是我们补充优质蛋白的重要来源，也是饮食中不可或缺的部分。选择乳制品时，蛋白质的含量是关键指标。乳制品中主要含有哪些活性乳蛋白？如何分析这些乳蛋白？本文分享了一种有效测定牛奶中乳白、乳球和乳铁蛋白的分析方法，可为液态奶的工艺优化提供数据支撑。
文/王象欣
牛奶蛋白质总量中大约20%[1]是乳清蛋白。乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（β-Lg，占乳清蛋白50%）、α-乳白蛋白（α-Lac，占乳清蛋白25%）[2]，其中β-Lg包含β-Lg A和β-Lg B两种遗传变异体。常乳中乳铁蛋白(Lf)的含量受奶牛品种和季节性的影响很大。[3] [4]
乳铁蛋白(Lf)是一种能够与铁结合的糖蛋白，可以促进肠道对铁元素的吸收，提高机体铁含量[11]；Lf还被称作免疫因子，具有抗菌[12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]和调节机体免疫力[15]等作用。GB 14880-2012《食品营养强化剂使用标准》将乳铁蛋白列为了新型营养强化剂，并规定了其在相关乳制品中的含量标准。
本研究采用超高效液相色谱法（UPLC），测定牛奶样品中乳铁蛋白(Lf)，α-乳白蛋白(α-Lac)和β-乳球蛋白(β-Lg)的含量。α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)和乳铁蛋白(Lf)的检测方法参照GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》对方法进行了确认，满足标准各项要求。
一、材料与方法
1试剂与耗材
本实验所用试剂乙腈（CH3CN）和三氟乙酸（CF3COOH）为色谱纯级别；
氯化钠（NaCl），磷酸二氢钠（NaH2PO4），磷酸氢二钠（Na2HPO4），冰醋酸为分析纯；
所用水由Milli-Q超纯水仪（默克公司）提供的符合GB/T 6682规定的一级水。
肝素亲和柱（4℃冰箱内储存），规格为1.5mg，3mL；0.22μm聚醚砜水相滤膜。
2仪器与设备
超高效液相色谱仪，配有紫外检测器；十万分之一分析天平；高速冷冻离心机；Milli-Q超纯水仪；涡旋振荡器。
3 标准物质
本实验所用标准物质为CRM级别，均来自于默克Supelco®品牌 Cerilliant®，其中乳铁蛋白(Lf)的标准品编号为 L-047；α-乳白蛋白(α-Lac)的标准品编号为L-045；β-乳球蛋白(β-Lg)的标准品编号为L-046。
4 分析方法
4.1 乳铁蛋白的测定
称取10g（精确至0.01 g）牛奶样品于100mL三角瓶中，先加入30mL结合缓冲液（84mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4），涡旋振荡混匀1min，将样品全部转移至容量瓶，再加入结合缓冲液定容至50mL后混匀；
将样本转移至离心管于4℃条件下以12000 r/min转速离心10 min，离心后轻轻取出中间层，上层有脂质，下面有沉淀，用大量程的移液器将中间液体部分吸出，注意不要吸取上层脂质和下层沉淀。取其中的10mL作为样品提取液。
肝素亲和柱先加入5 mL结合缓冲溶液（84mmol/L Na2HPO4，16 mmol/L NaH2PO4）平衡，处理完毕后加入样品提取液，待样液完全流出后，再用10 mL淋洗液（42mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L NaCl）淋洗，弃去全部流出液。
最后用2.5 mL洗脱液（42mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，1mol/L NaCl）洗脱，收集全部流出液，定容至3.5 mL。将收集溶液过滤膜，供液相色谱检测分析用。通过C4色谱柱（100 mm×2.1mm，1.7μm，300Å）进行分离。
梯度洗脱，流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈；梯度条件见表1所示，流速为0.3mL/min，柱温为45 ℃，进样量为10μL；通过紫外检测器280 nm下进行检测，样品色谱图见图1所示。
表1：乳铁蛋白梯度洗脱条件
图1 牛奶样品中Lf的色谱图
4.2 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的测定
取5 g（精确至0.01 g）牛奶样品至50mL离心管中，加入15.0mL水混匀，加入冰醋酸（约30μL）调节pH为4.6±0.1左右，涡旋震荡1min，室温静置至少20min后，在10000转，4℃条件下离心10min。
取1mL上清液稀释10倍后，过0.22μm滤膜，上机检测。通过C4色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm,300Å）进行分离。梯度洗脱，流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈；
梯度条件见表2所示，流速为0.3mL/min ，柱温为45 ℃，进样量为10μL；通过紫外检测器280 nm下进行检测，样品色谱图见图2所示。
表2：α-乳白蛋白和β-乳球蛋白梯度洗脱条件
图2 牛奶样品中α-Lac和β-Lg 的色谱图
二、实际样品的测定数据
牛奶样品来自11个省份、自治区、直辖市的大型超市，并结合网络，抽取试验所用样品。其中20种保质期为常温12个月的纯牛奶，20种保质期为常温6个月的纯牛奶，10种ESL牛奶，15种巴氏杀菌牛奶，每种10个批次。对上述样品按照2.4所述方法进行分析，结果如表3所示。
表3：市售样品中未变性α-Lac、β-Lg、Lf的含量
三、结论
经方法学验证，3种活性蛋白其线性范围内线性关系良好，方法回收率、精密度符合GB/T 27404-2008中的相关要求，该方法快速、灵敏、准确，适合牛奶样品的检测，也可为液态奶的工艺优化提供数据支撑。
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