深入解析基因的功能及与其相互作用关系是分子生物学的主要目标。质谱法与传统的生物化学工具如亲和纯化或排阻色谱法结合，不仅能表征整个蛋白质的组成，而且可以直接检测蛋白质间的相互作用。虽然其功能强大，但是用这些方法深入了解蛋白的原位状态，反映蛋白质与代谢物，蛋白质与核酸等相互作用方面仍然具有挑战。
2020年12月9日，德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Athanasios Typas课题组和Mikhail M. Savitski课题组合作在Nature杂志上发表题为"The functional proteome landscape of Escherichia coli"的文章，在本研究中，作者结合反向遗传学和热蛋白质组技术（TPP，thermal proteome profiling）描述大肠杆菌中的遗传扰动对蛋白质丰度和热稳定性的影响，为推断蛋白质功能和相互作用提供了丰富的资源。
研究材料：121株大肠杆菌（来自Keio library的单基因缺失突变体）
技术方法：热蛋白组学，代谢组学
实验路线图：
研究结果：
1. 高通量热蛋白质组学分析
作者对121株大肠杆菌（单基因突变体）进行热蛋白组学分析，即对生长至指数阶段的突变体，加热10个不同温度以诱导蛋白变性，随后收集每个温度下细胞裂解后的可溶性蛋白，通过TMT标记定量蛋白组学方法进行检测（总共2420个样本：121个突变体×2个重复体×10个温度） 。结果表明：2586个蛋白至少含有2个唯一肽段，在整个遗传背景下，检测到1764种蛋白质的丰度和热稳定性，其中 1213种蛋白质发生了显着变化，而热稳定性和丰度测量值在很大程度上正交。
图1.热蛋白质组分析实验流程及结果分析
2. 必需蛋白热稳定性研究
由于必需基因（essential genes）的功能很难用遗传学方法来研究，作者探讨了必需基因在遗传扰动中表现。结果显示，由必需基因编码的蛋白丰度更高，且丰度变化的频率低于非必需基因编码的蛋白，此外必需蛋白比非必需蛋白的稳定性更易受到温度影响，这提示它们的活性或相互作用非常容易在某些遗传背景下受到调节。
作者进一步通过CRISPRi技术，降低不同遗传背景下FtsK（一种细胞分裂DNA移位酶）和ParC（拓扑异构酶IV的亚基）的水平，证实了其对野生型细胞的生长状态影响轻微，但是细胞不能耐受在热稳定性受到影响的突变体中必需蛋白的消耗。这些数据提示细胞维持高水平的必需蛋白用于缓冲它们在不同条件下的活性变化，这种必需和非必需基因的合成致死性可以为组合药物治疗提供新途径。
图2.不同遗传背景下，必需蛋白的改变状态，而非丰度变化
3. 功能相关蛋白的研究：蛋白丰度和热稳定性共同变化
作者通过斯皮尔曼相关性分析来评估在不同温度下121个遗传扰动中共同改变的蛋白对。结果表明：蛋白复合物（PRNAP），操纵子，代谢途径相关蛋白（组氨酸生物合成）等高度相关，蛋白热稳定性能力不仅能够进一步捕捉蛋白的功能关联性，而且可以根据每个数据集中的已知蛋白的生物学功能（GO注释），对高度相关未知功能蛋白（孤儿蛋白）进行功能链接，共发现140个孤儿蛋白可能与已知的生物过程相关。
图3. 蛋白质丰度和热稳定性的共同变化是功能关系的重要标志
4. 代谢酶热稳定性研究：酶的热稳定性反应了酶的活性
为了解析代谢能力与酶活性变化的关系，作者利用代谢组学技术对19个突变体和野生型大肠杆菌细胞中糖酵解和柠檬酸循环代谢物进行分析，发现这些代谢物水平有着巨大变化；这种变化情况与酶热稳定性之间存在显著相关性，但与酶丰度无关。这些数据进一步验证了酶的热稳定性可以反映细胞内代谢物（作为底物或者产物与酶相互作用）的水平。因此，TPP捕捉体内的酶活性，为解析细胞代谢状态，揭示酶与代谢途径关联能力提供了独特的视角。
图4. 蛋白质热稳定可以捕获体内酶的活性
小编小结：
作者通过热蛋白组学分析结合分子遗传学方法，首次系统性描绘大肠杆菌突变体蛋白质的丰度和热稳定性，确定了多种潜在的新的相互作用，也给未知功能蛋白赋予了功能注释，并且为代谢物活动测量提供了一种新的方法。综上所述，该研究提供的数据集可用于深入了解蛋白质的功能和关联性，该种方法也可以拓展应用于其他生物体功能蛋白的研究。
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