人AAVS1位点的TALENs质粒活性验证

摘要：利用T7E1 活性分析实验验证AAVS1位点的TALENs质粒对的活性。实验表明，该质粒对可以识别CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列，切割效率约为10%。配合Donor质粒，可以高效地将外源基因定点插入到AAVS1位点。可用于筛选定点整合稳定细胞株。
关键词：T7E1，AAVS1，TALENs， 定点整合稳定细胞株

一、 实验原理
在293T细胞中共转针对AAVS1位点的TALENs质粒， TALENs质粒会表达相应的蛋白如果具有切割活性将会在识别位点中间预测的位置造成DNA双链断裂，在细胞进行易错修复后造成随机的突变(一般会缺失部分碱基，某些情况下也会添加)。当利用引物切割位点上下游的引物进行PCR的时候，产物为两类PCR产物的混合物：正常序列的PCR产物和突变序列的PCR产物。对PCR产物进行变性和退火以后，这两类产物会随机配对，会有一部分正常序列的PCR产物和突变序列的PCR产物组成杂合链。在使用可以特异识别不完全配对区域的T7E1酶处理后，杂合链将会被切断。利用DNA PAGE胶，相对于对照组会有预测大小的切割条带出现。如果TALENs质粒没有活性，则不会有切割条带出现。

二、 实验目的
验证识别CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割质粒对在293T细胞中的切割活性。

三、 实验步骤
1. 引物设计合成：
AAVS1-F1-311 : CCTGTCATGGCATCTTCC
AAVS1-R1-311 : TAAGGAATCTGCCTAAC
位于TALENs识别位点上下游，可获得311bp长PCR产物，用于T7E1实验。
2. TALENs细胞样品的准备：
293T细胞70%汇合度时按照转染试剂说明书，共转AAVS1 TALENs质粒， 同时转染TALENs空质粒作为对照， 转染3天后， 收集样品， 抽提基因组DNA。
3. PCR：将基因组DNA作为模板，使用AAVS1-R1-311和AAVS1-F1-311引物进行PCR，得到311bp产物。

                                                                   PCR反应体系

                                                           PCR循环条件
                                          

                                                           1    2    3

1． Con
2． TALENs treated
3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

4. T7E1活性分析实验-退火：
取以上PCR产物(311bp)各10μl， 放入PCR按照以下程序进行退火： 95℃ 5 min， 以-2度/秒的速度降至85度，再以-0.1度/秒降至25度， 4℃保存。
5. T7E1活性分析实验-酶切：
每个样品加入1μl T7E1酶，37℃酶切40min。
6. T7E1活性分析实验-DNA PAGE电泳，染色：
酶切好的样品加入5X Orange G 上样缓冲液，在12%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使用1XTBE作为电泳缓冲液，恒压80V电泳15min后150V电泳至 Orange G染料至底部。凝胶取下后，在50ml 1XTBE 中加入10μl gold view 染料，摇床震荡10min后，用去离子水洗三次。紫外凝胶成像仪观察，拍照。

                                   
                                             图1. T7E1切割活性检测PAGE胶电泳图

四、 实验结果
T7E1活性分析实验结论：
TALENs转染组的T7E1酶切后可见两条预测大小的切割条带（~208bp，~103bp），在对照组同样位置没有发现同样大小的条带。结果证实pTALEN-AAVS1-F和pTALEN-AAVS1-R质粒对在293T细胞中具有切割活性。经过灰度分析，切割效率约为10%。

五、 参考文献
1. Ramakrishna S, Kim YH, Kim H.Stability of zinc finger nuclease protein is enhanced by the proteasome inhibitor MG132. PLoS One. 2013;1:e54282