单细胞转录组测序

单细胞转录组测序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术，原理是将分离的单个细胞中微量的mRNA通过扩增后再进行高通量测序。单细胞转录组测序能够有效解决组织样本细胞异质性以及常规RNA-seq被掩盖的细胞群内的转录组异质性难题，有助于发现新的稀有细胞类型，并深入了解细胞生长过程中的表达调控机制。

基于10x Genomics新Chromium系统，利用油包水的微反应体系，通过序列标签（cell barcode和UMI）区别群体中的不同细胞和转录本，获得单细胞水平的基因表达谱，可实现数千甚至上万个单细胞群体分析，解决常规scRNA-seq方法在通量或扩展性方面存在的不足，为单细胞研究开拓新的思路。

技术优势 

通量高
一次可以同时测8个样本
每个样本至多可测10000个细胞
周期短
6分钟内完成上万个细胞封装
一天之内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库
捕获效率高
单个细胞捕获效率高达65%
应用范围广
动物细胞、植物细胞均可以进行单细胞测序
广泛应用于肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育等研究

技术原理

利用8通道的微流体“双十字”交叉系统，将含barcode的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs。
GEMs形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA，再构建标准测序文库。

建库流程

案例展示

案例一  通过10× genomics单细胞转录组测序绘制肺癌肿瘤微环境图谱 
Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment 

研究背景

肿瘤周围的组织、免疫细胞、血管和细胞外基质共同形成的肿瘤微环境对肿瘤的生长和侵袭至关重要，本研究试图通过单细胞转录组测序揭示肺癌肿瘤微环境的特征。

技术路线

研究结果

文章共选取5例共19个样本，通过10×genomics单细胞转录组测序探索基质细胞的亚群分类、基因功能（信号通路）、关键marker基因和临床预后。共鉴定出52个基质细胞亚群，反映了肿瘤微环境复杂性。对基质细胞的marker基因做生存曲线，发现这些marker基因可以作为肺癌预后诊断的潜在标志物。

参考文献
Lambrechts D, Wauters E, Boeckx B,et al. Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment. Nature medicine, 2018, 24(8): 1277.（IF：32.621）

常见问题

1. 为什么每个样品需要那么多的细胞量？
答：细胞在上机之前，需要对进行一系列的质检，质检过程需要用掉部分细胞。

2. 如何检测细胞活性？
答：可以使用台盼蓝染色，用显微镜观察细胞活性。

3. 植物细胞能做单细胞测序吗？
答：植物细胞可以做单细胞测序，但需要注意两点：1. 需要注意细胞大小，10× genomics的适用对象是直径小于40μm的细胞。2. 植物细胞含有细胞壁，细胞壁对后续裂解有影响，所以需要用纤维素酶等消化细胞壁，制成原生质体。

4. 单细胞测序需要和常规转录组一样设置重复吗？
答：单细胞测序的目的是分离群体细胞中的不同亚群，表征这些亚群的特征，我们建议老师最好有实验组和对照组，但一般对生物学重复没有要求。