16S rDNA测序是利用高通量测序技术对样品微生物的16S rDNA扩增产物的片段进行测序，能够对特定条件下细菌种类和丰度进行有效的鉴定。16S rDNA 指细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子对应的DNA序列。16S序列由9个高变区组成，中间是保守区，是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的DNA，扩增其中16S rDNA基因，可以鉴定绝大多数细菌。基于Illumina MiSeq平台的16S rDNA测序可以一次性完成多个样本的平行测序，可以进行样品中细菌多样性、物种丰度、种群结构和系统进化等诸多信息分析。

 1、实验方案
      测序策略：Illumina MiSeq PE300/PE250
      数据量：每个样>5万条clean reads

2、技术优势
（1）准确性高：从碱基保守水平测定，真实反映物种情况；
（2）快速高效：相比于传统鉴定方法，16S测序鉴定微生物更快速和准确；
（3）过程简单：环境样品的最优解决方案，完全摆脱繁杂的菌株分离工作；
（4）灵敏度高：可以鉴定到低丰度细菌；
（5） 降低成本：需测序数据量少，检测成本低。

3、数据分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；
（2）Tags拼接、过滤；
（3）物种组成分析（与RDP、Silva、GreenGene等数据库比对）；
（4）OTU统计及venn图分析；
（5）OTU Rank曲线；
（6）物种积累曲线；
（7）物种注释及其丰度分析（柱状图和热图分析）；
（8）物种系统进化分析；
（9）单个样本复杂度分析（α多样性分析）；
（10）样本间/组间α多样性差异统计分析及盒形图；
（11）样品间复杂度分析：β多样性heatmap分析；
（12）β多样性PCoA分析（2D/3D）；
（13）NMDS-2D/3D分析；
（14）样本组间差异分析：Adonis分析，相似性分析，RDA/CCA分析等；
（15）不同样本间物种组成聚类分析（样品数≥3）
（16）其他高级分析：比如PICRUSt预测宏基因组的功能组成。

4、技术流程


5、案例分析
       案例（1）多发性硬化病与肠道微生物组的关系
       肠道微生物对于免疫系统的功能发挥着重要的意义，同时与多种自身免疫疾病相关。Beth Isreal Deaconess医疗中心的人员使用Miseq和454测序仪，通过对60例MS（多发性硬化疾病）患者和43例健康人进行肠道16s rRNA测序并分析，发现MS患者的肠道中Methanobrevibacter和Akkermansia两种菌丰度增高，同时还伴有Butyricimonas的丰度降低。接受治疗后，患者肠道中Prevotella和Sutterella的丰度有所上升，Sarcina有所降低。提示了肠道微生物的菌种改变有助于发现MS起病原因。

图1 MS患者和健康人肠道微生物的差异分析
       案例（2） 红斑狼疮患者兼患牙周炎龈下牙垢16S rDNA测序揭示口腔微生物的多样性
       红斑狼疮是免疫系统疾病，很多患者会同时患有口腔疾病。该研究募集了52例SLE患者（伴有牙周炎35例，无牙周炎17例）和52例非SLE对照（伴有牙周炎28例，无牙周炎24例）；共采集104份龈下牙垢，提取总DNA后，利用Illumina Miseq平台行16S rDNA测序V4区域。SLE患者牙周炎发生地更加普遍且更严重，且年龄更小。SLE会影响口腔微生物的多样性。在患有牙周炎的群体中，SLE患者较对照组口腔微生物多样性低。微生物的相互关系分析中，非SLE对照样本共鉴定到89个细菌关联，而SLE患者样本中共发现了111个细菌关联。

图1 对照组（红色）和非牙周炎SLE样本（绿色）具有不同相对丰度的OTU

参考文献
[1] Jangi et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications, 2016.
[2] Corrêa et al. Subgingival microbiota dysbiosis in systemic lupus erythematosus: association with periodontal status. Microbiome, 2017.