RNAi

一、RNAi服务介绍
 
研究表明，将与mRNA同源的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而抑制其相应基因的表达。这种转录后基因沉默机制（Post-transcriptional gene silencing, PTGS）被称为RNA干扰（RNAi）。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

我们应用国外知名公司的RNAi Designer平台，可对靶基因序列进行干扰位置效应评价和序列同源型分析，完成siRNA/miRNA多种序列的的设计，并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。
 

二、服务内容：
 
1、siRNA合成： 
对于瞬时基因沉默实验，化学合成siRNA的方法操作简便，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强。我们通过严格设计来增强siRNA的专一性；针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到75％（染效率大于80％的情况下）。

实验流程： 

1）根据序列信息，进行化学合成 ；

2）纯化及定量 ；

3）冻干处理 ；

4）细胞转染预实验，优化转染条件； 

5）瞬时转染或稳定转染 ；

6）RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化 。

 
2、质粒载体shRNA的构建：
构建shRNA表达载体，实现shRNA在细胞中稳定表达，能够弥补瞬时转染持续时间短的不足。

实验流程： 
1）mRNA序列分析； 
2）引物设计及合成； 
3）单链互补引物退火； 
4）将片段克隆至载体； 
5）测序以确保插入序列正确性； 
6）向客户提交测序结果与实验方法报告单。

3、microRNA干扰载体构建：
RNAi载体表达可以稳定地研究基因功能，载体在细胞种持续抑制靶基因的表达可达数星期甚至更久。 RNAi载体利用细胞内源性的miRNA加工机制，相比传统shRNA载体可更高效地表达RNA发夹结构。每个基因设计的4条序列，我们保证至少有2条可以达到至少70％转录水平的Knockdown效率（在转染效率大于80％的情况下）。 

实验流程：
1）针对特定基因，设计micro RNAi序列，合成该序列并退火生成双链DNA；
2）将DNA与载体连接并转化 ；
3）测序验证miRNA序列的正确性 ；
4）细胞转染预实验，优化转染条件 ；
5）瞬时转染或稳定转染 ；
6）RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化。

4、RNAi干扰效果检测：
应用RT-PCR方法检测mRNA水平的基因敲除效果；通过Western blot方法检测蛋白水平的基因敲除效果。
 

三、服务说明 

1、siRNA合成

客户提供：
1）目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat种属）以及技术要求（包括OD和nmols的精确数量、纯化类型和修饰要求等） 
2）细胞株和详细的细胞培养的操作步骤 
3）一抗（如果需要Western blot检测）

注：普通siRNA：均有HPLC纯化，100％除去尚未配对的单链 ；化学修饰siRNA：利用修饰以提高siRNA在血清和培养基种的稳定性；荧光标记siRNA；siRNA对照：普通阴性对照、荧光标记的阴性对照（易观察，可观察转染效率）和siRNA阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在您的实验方法是可靠的；
 
2、质粒载体shRNA的构建 

客户提供： 待研究mRNA序列信息。 
 
3、microRNA干扰载体构建

客户提供： 

1）目的基因的Accession Number（Human、Mouse或Rat种属） 
2）细胞株和详细的细胞培养的操作步骤 
3）一抗抗体（如果需要Western blot检测）

4、服务价格与周期：

四、质量承诺： 

1、siRNA合成：
1）转染效率分析 ；
2）Knockdown结果。
针对靶基因设计的3条siRNA可保证其中2条的Knockdown效率达到75％（在转染效率大于80％的情况下）。

2、质粒载体shRNA的构建：
1）阳性克隆质粒；
2）阳性克隆甘油菌；
3）测序报告以及实验方法报告。

3、microRNA干扰载体构建：
1）构建好的表达载体和相应的甘油菌；赠送阴性对照甘油菌 ；
2）测序报告 ；
3）转染效率分析 ；
4）Knockdown结果。
针对某靶基因设计的3条miRNA序列，在转染效率 > 80％的前提下，我们保证至少有1个克隆可以达到70％转录水平的沉默效率服务流程 。