大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简单,一般使用酚氯即可获得满意结果。
材料
提纯TMV病毒液(10mg/ml)。
操作步骤
1、取eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400ml,再加入等体积酚/氯,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟。
吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
2、吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离心10分钟。
3、取水相,加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
4、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。
6、取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成。
[注意]
1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯的抽提。