实验技术服务-实时荧光定量PCR

 
 
实验原理
 
      实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种：荧光染料和荧光探针。
 
      荧光染料SYBR Green：嵌入到双链DNA分子后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，见下图：
 

 
      TaqMan荧光探针：扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，见下图。
 

实验流程

 
实验结果展示
 

图1 A、B两种细胞经加药处理后目的基因在各个时间点的qPCR相对定量表达检测
1）目的基因的扩增曲线与熔解曲线；
2）内参基因的扩增曲线与熔解曲线；
3）目的基因在A、B两种细胞加药处理后各个时间点的表达量柱形图