qPCR介绍

       实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescence Quantitative PCR，RT-qPCR）简称定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）。qPCR 是在 PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或者内参基因对未知模板进行定量分析。qPCR可用于mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA等的定量检测。
 

qPCR的原理

       qPCR包括染料法和探针法两种。染料法qPCR是利用荧光染料与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，如SYBR Green I。SYBR Green I与DNA双链结合时发出的荧光强度是有游离时的1000倍。探针法qPCR是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，如Taqman探针。Taqman 探针长度为 20-24 bp， 在其 5’末端标记一个荧光报告基团， 3’末端标记一个荧光淬灭基团， 其序列与PCR扩增产物内的一段 DNA完全互补。探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而淬灭作用被解除， 荧光信号释放。染料法简便易行，成本较低；探针法则由于增加了探针的识别步骤，特异性更高。

qPCR的实验流程
 

1、合成引物、标记探针。
2、提取样品的RNA。
3、检测RNA的浓度和纯度。
4、RNA电泳检测。
5、除去RNA中的DNA。
6、反转录合成第一链cDNA。
7、配置反应液，上机检测。
8、qPCR产物电泳检测。
9、数据分析。
 

qPCR服务的范围
1、可检测的样本包括细胞、组织、全血、血浆、粪便等。
2、可检测的分子包括mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、DNA等。
 qPCR服务的优势1、用primer blast网站设计特异性高的qPCR引物，用oligo 7软件筛选扩增效率高，不形成二聚体或者发夹结构的qPCR引物。一对qPCR引物中至少一条跨外显子结合区，排除DNA的干扰。
2、qPCR产物电泳确保没有二聚体或者发夹结构。
3、完整、真实的原始数据，并且进行专业的数据分析。
4、完整的实验报告，包括RNA电泳图、扩增曲线、溶解曲线、qPCR产物电泳图、原始数据、数据分析表、柱形图等。 qPCR的结果示例

RNA电泳图



扩增曲线



 溶解曲线



qPCR产物电泳图
 

qPCR服务说明
 

1、客户提供样品。
细胞≥10^5个，组织≥100 mg（黄豆粒大小），全血≥0.5 mL，血浆≥2 mL，基因组DNA≥5 μg。检测指标多余10个需要提供更多样品。
建议所有样本干冰寄送，保持低温环境，保证样本质量。
2、HYY提供RNA电泳图、扩增曲线、溶解曲线、qPCR产物电泳图、原始数据、数据分析表、柱形图和说明实验过程中所用的耗材、仪器设备、实验方法的实验报告一份。
3、实验周期1～2周。样品和指标较多适当延长实验周期。