实时荧光定量PCR
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实时荧光定量PCR

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上海洛成生物科技有限公司

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产品描述

定义:
    PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。
    所谓的实时荧光定量PCR,其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线(如图1)。

 
方法:
SYBR Green Ⅰ荧光染料法
•SYBR Green Ⅰ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green Ⅰ的zei大吸收波长约为497nm,发射波长zei大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射强荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱荧光信号背景,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。


 
TaqMan荧光探针法
•PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如下图所示。


 
优缺点:
 
相对于荧光染料的方法,探针的方法更准确,可信度也相对较高,实验本身的影响因素比较少,因而,实验的可操作性,可重复性也好,但是,探针的方法,相对于染料的方法来说,价格相对较高,成本也高。如果实验资金允许的话,还是选用探针的方法更好一些。
 

 

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