细胞增殖、毒性检测
实验介绍
(a) MTT
MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂,生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中,甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比(死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失,不能还原MTT)。还原生成的甲月替结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠(PH 4.7)或10%酸化十二甲基磺酸钠(PH 4.7)的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出OD值,即反映活细胞数目。也可利用DMSO(二甲基亚砜)来溶解。用DMSO之前要尽量去掉培养液,一遍DMSO溶解甲月替颗粒,进行比色测定。
1.取96孔细胞培养板,每孔中加0.1ml含2×104~10×104靶细胞的培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养液),在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2~3小时让细胞帖壁(如果是悬浮细胞可直接进行下一步)
2.用RPMI-1640培养液2~10倍递次稀释细胞因子标准品,根据情况2~5倍递次稀释待检样品,每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品,每个稀释度3个重复孔。对照孔6个:3个阳性对照孔,每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液,3个阴性对照孔,每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24~48小时或预定的时间。
3.吸去培养液,用PBS洗涤一次(如为悬浮细胞,应在吸去上清液前离心培养板)。
4.每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液,在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4~6小时。
5.每孔加0.1ml酸化异丙醇,也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇,在振荡器上振荡混匀,让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度(OD)值,检测波长570nm,参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图,比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
(b) CCK-8检测细胞增殖(活力):
CCK-8(cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTT、XTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。
当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。
(c) XTT:
化学名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide,作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤,XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物(formazan)。代谢产物在OD450处有吸收峰。
优点:1、使用方便,省去了洗涤细胞;2、检测快速;3、灵敏度高,甚至可以测定较低细胞密度;4、重复性优于MTT。
缺点:XTT水溶液不稳定,需要低温保存或现配现用。
应用范围:
生物活性因子的活性检测;
大规模的抗肿瘤药物筛选;
细胞增殖实验;
药物或基因导致的细胞毒性试验;
药敏试验等。
服务周期:3周。
Transwell 细胞迁移实验
一、实验介绍
细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
二、实验步骤
1、材料准备:
可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)
2、步骤和流程
2.1基质胶铺板:
用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞
①取细胞悬液100 ul 加入Transwell小室。
② 24孔板下室一般加入600 uL含20% PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.4结果统计
直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。
取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。
0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。
400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。
实验周期:
1个月
威斯腾实验服务流程
威斯腾生物服务项目
分子生物学检测 | 蛋白质与免疫学 | 动物实验 |
实时荧光定量PCR | 单克隆抗体制备 | 帕金森疾病模型 |
免疫共沉淀(Co-IP) | 多克隆抗体制备 | 抑郁症动物模型 |
ELISA(酶联免疫吸附法)技术 | Western-blot 实验服务 | 脊髓损伤模型 |
生化指标检测 | 蛋白双向电泳实验服务 | 脑外损伤模型 |
双荧光素酶报告基因检测 | 原核蛋白表达纯化 | 骨神经损伤模型 |
染色质免疫共沉淀(ChIP) | 真核蛋白表达纯化 | 心肌缺血模型 |
GST pull Down | ITRAQ定量蛋白质组学 | 心力衰竭模型 |
SILAC蛋白组学 | 肺动脉高血压动物模型 | |
高血压模型 | ||
病毒包装 | 实验课题整体外包 | 粥样动脉硬化模型 |
过表达/干扰慢病毒包装纯化 | 整体课题外包 | 大脑中动脉阻塞模型 |
过表达/干扰腺病毒包装纯化 | 细胞整体实验外包 | 慢性之气管炎模型 |
逆转录病毒包装纯化 | 动物整体实验外包 | 过敏性哮喘模型 |
腺相关病毒包装纯化 | 肺炎大鼠模型 | |
肝炎-肝硬化-肝癌模型 | ||
蛋白芯片 | 原代细胞培养 | 肝纤维化模型 |
细胞因子芯片 | 骨髓间充质干细胞培养 | 胆结石模型 |
BioPlex悬浮芯片 | 脂肪干细胞培养 | 急性胰腺炎模型 |
生长因子芯片 | 心肌成纤维细胞培养 | 急性肾衰竭模型 |
炎症因子芯片 | 软骨细胞培养 | 体内血栓模型 |
血管生成因子芯片 | 血管内皮细胞培养 | 关节炎模型 |
凋亡因子芯片 | 神经元细胞培养 | I型和II型糖尿病模型 |
趋化因子芯片 | 内皮组细胞原代培养 | 裸鼠成瘤 |
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 | 基因编辑动物 | |
电生理相关服务 | 动物整体实验服务 | |
膜片钳实验 | ||
细胞生物学检测 | 高通量测序 | 代谢组学 |
细胞原代培养 | mRNA测序 | 气相色谱GC/MS |
MTT检测 | LncRNA测序 | 液相色谱LC/MS |
细胞凋亡检测 | 全基因组测序 | 核磁共震NMR |
细胞周期检测 | RNA-Seq测序 | |
细胞克隆形成实验 | 外显子测序 | 影像学相关实验 |
Transwell细胞迁移/侵袭 | 16s扩增子测序 | Micro-CT |
流式分选 | Small RNA测序 | 小动物活体成像 |
CCK8/XTT检测 | 宏基因组测序 | 核磁共振 |
台盼蓝检测细胞活性 | 单细胞测序 | PET-CT |
药物筛选细胞学实验 | circleRNA测序 | |
细胞粘附性检测 | 甲基化测序 | 基因编辑动物 |
细胞划痕实验 | 条件性敲除小鼠/大鼠 | |
细胞生物学整体实验 | 全基因敲除小鼠/大鼠 | |
细胞成管实验 | ||
病理检测 | CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 | 基因芯片 |
扫描电镜 | 基因定点突变细胞系 | LncRNA芯片 |
透射电镜 | 单基因敲除细胞系 | miRNA芯片 |
HE染色 | 多基因敲除细胞系 | mRNA芯片 |
免疫组化 | 目的基因敲入细胞系 | 甲基化芯片(限人和小鼠来源样本) |
Tunel(原位末端凋亡法)检测 | 报告基因敲入细胞系 | SNP芯片(限人和小鼠来源样本) |
激光共聚焦 | miRNA/LncRNA敲除细胞系 | |
免疫荧光 | ||
Masson染色 | CRISPR/Cas9动物敲除/敲入 | 科研设计指导&文章评估/润色 |
原位杂交 | 基因敲除大鼠/小鼠 | 科研文献论著翻译 |
荧光原位杂交 | 基因敲入大鼠/小鼠 | 论文翻译润色服务 |
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等) | 临床实验/科研实验设计方案指导 | |
行为学检测 | 药物筛选服务项目 | 药效学评价 |
旷场实验 | 高通量自动药物筛选平台 | 抗肿瘤药物药效学评价 |
重复性刻板行为检测 | 细胞高内涵药物筛选平台 | 心血管系统药物药效学评价 |
动物跑台检测 | 蛋白质组学靶标研发平台 | 泌尿系统药物药效学评价 |
强迫游泳 | 分子药理研究平台 | 内分泌系统药物药效学评价 |
生物膜片钳药物筛选平台 | 抗炎免疫药物药效学评价 | |
常规药物体外筛选 |
【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务!