当前，microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。英拜生物可为您提供microRNA报告基因载体构建服务，并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列，本公司专业技术服务人员就可替您完成载体构建，为您节省大量的时间和精力。

   下图为microRNA-reporter和microRNA-control载体表达框架示意图，报告载体表达萤火虫荧光素酶，并在其3’端具有克隆位点，方便插入靶基因3’UTR序列。内参照载体采用海肾荧光素酶作为报告基因，用于进行归一化处理和阳性筛选。

     

 

 microRNA-reporter载体　　　     　　　　　　           microRNA-reporter control载体

英拜生物microRNA报告基因实验流程：

1.microRNA靶点的预测

利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列(客户提供)。

2.获得microRNA对应DNA模板

根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增目的microRNA靶基

因3’UTR序列。

3.microRNA靶序列克隆

将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切

的miR-reporter载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。

4.阳性克隆鉴定。

挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序

列一致。

5.细胞转染准备

将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA　mimics或microRNA

negative control共转染293T或Hela细胞。

6.荧光素酶检测

共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，即同时检测firefly luciferase和renilla

luciferase活性，确定目的microRNA的靶基因。

7.突变实验

构建miR-reporter载体（含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体）与内参质粒、microRNA

mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后，进行双

荧光素酶检测，进一步验确定目的microRNA的靶基因。

8.整理分析数据，得出结论。

提供有microRNA靶序列的报告质粒，以及内参和对照质粒各一份。甘油保存菌株各一支。附

miR-reporter载体的说明书，以及实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞

转染，荧光检测。

 

注：

microRNA　mimics与microRNA negative control由客户提供或由本公司代购（Dharmacon公

司),也选用Pre-miR 与Pre-miR negative control（Ambion）或构建microRNA过表达载体及对

照载体（本公司可以构建