简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq

Methyl RAD技术（Wang et al., Open Biol., 2015）使用了甲基化修饰依赖性内切酶，如FspEI、MspJI、LpnPI、AspBHI等，此类内切酶会识别DNA上发生甲基化的胞嘧啶，在识别位置的下游隔一定距离切割双链。若DNA双链具有中心对称甲基化状态，则可以切割产生一个固定长度的双链DNA片段。对酶切产生的标签建库测序，即可进行甲基化位点的定性和相对定量分析。

欧易特色
文库构建简便快速，不经过片段大小选择，保证了实验的重复性
具有较强的灵活性，标签密度可控
标签长度一致，PCR扩增效率一致，测序深度均一
具有单碱基分辨率，可以做到甲基化位点的定性和相对定量分析
甲基化位点检测的假阳性率能够控制在0.50%以内（WGBS假阳性率在0.28%-0.50%）
提供标准和高级生物信息分析，可根据客户需求提供个性化数据分析
所需的样本DNA起始量较低
有参无参物种均可，既可用于未知甲基化位点的开发，也可用于不同样本间的甲基化位点的差异研究

推荐测序模式
● Hiseq X-Ten，PE150    ● 30 M reads/1 G基因组大小

案例展示
案例一  腭融合过程 EMT 机制调控研究

研究背景
腭突上皮细胞发生上皮-间质转化（EMT）是腭融合的关键环节，但是分子水平的调控机制，尤其是胚胎腭发育过程中的增强子甲基化的调控研究，仍不清楚。

研究内容
欧易生物携手汕头大学医学院第二附属医院，采用 Methyl RAD 技术对 6 个小鼠胚胎上鄂组织（实验组为全反式视黄酸处理；对照组为等量的玉米油处理）进行全基因组甲基化研究，通过筛选差异甲基化位点（CCGG 和 CCWGG）、GO 和 KEGG 富集分析，发现腭融合过程调控 EMT 的 3 个基因的增强子甲基化水平发生变化，可作为唇裂治疗的新表观遗传标记。

研究结果
1. 6 个小鼠胚胎上颚组织共获得 800M clean reads，其中 325M reads 具有酶切位点，234M reads 能比对到参考基因组。检出的差异甲基化位点 CCGG 和 CCWGG 位点分别为 17299 个和 2363 个（p < 0.05, log2FC >1），CCGG 位点平均深度不低于 29X，CCWGG 位点平均深度不低于 8X。
2. 聚类分析结果表明，差异甲基化位点在实验组的甲基化水平高于对照组的甲基化水平，另外，实验组和对照组的甲基化模式不同，存在明显的个体内和个体间甲基化差异。
3. 相比于 DNA 元件中的其他区域，大多数甲基化位点位于内含子和基因间区。
4. 筛选与腭部融合有关、并调控 EMT 的基因，并检测这些基因增强子的甲基化变化，结果 HDAC4、PDGFR 和 TCF7L2 的差异甲基化位点 CCWGG 位于内含子的非 CpG 岛。其中，HDAC4 增强子的差异甲基化位点发生了高甲基化，而 PDGFR 和 TCF7L2 增强子的差异甲基化位点发生了低甲基化，可作为腭融合治疗的靶标。

参考文献
Shu X, Shu S, Cheng H, et al. Genome-Wide DNA Methylation Analysis During Palatal Fusion Reveals the Potential Mechanism of Enhancer Methylation Regulating Epithelial Mesenchyme Transformation. DNA Cell Biol 2018; 37(6): 560-573. (IF: 2.236).

常见问题

1. Methyl RAD 技术中使用的是什么类型的酶？
以其中一种内切酶 FspEI 为例，其识别序列为 5’-CC-3’，且第二个胞嘧啶需发生甲基化，在此胞嘧啶所在链的右侧第 12 个碱基处、反向链右侧第 16 个碱基处进行切割，此时若反向链中心对称位置上存在同样的识别位点，则可切割产生 Methyl RAD标签，用于建库测序。

内切酶 FspEI 的识别及酶切位点

2. Methyl RAD检测到的甲基化位点数量如何？
Methyl RAD技术文章（Wang et al., Open Biol., 2015）中有Methyl RAD 和WGBS在拟南芥中检测到的CCGG和CCWGG两种甲基化位点的数量对比，从中可以看出二者的检出数量吻合度非常高。

Methyl RAD、W GBS检测到的甲基化位点数量对比
（a、b图中的三行分别对应：基因组上预测出来的、WGBS检测到的、MethylRAD检测到的CCGG/CCWGG位点）
3. 如何调整标签密度？
Methyl RAD技术既可以增加标签密度，也可以降低标签密度。增大密度：可同时使用两种或两种以上的内切酶进行建库测序；降低密度：酶切后产生的片段为粘性末端，并且粘性末端的碱基是随机的。因此，在对酶切片段连接接头的过程中，可通过选择性接头特异地选择部分标签进行建库，以达到降低密度的目的。

参考文献
Wang S, Lv J, Zhang L, et al. MethylRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylat ion-dependent restriction enzymes. Open Biol. 5, (2015). (IF: 4.822)