酵母表达蛋白服务广州康遂生物科技有限公司

产品描述

步骤1. 目标基因亚克隆至酵母表达载体：

     扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
     将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
     测序验证构建质粒的准确性。
     可提供表达载体：pPICZα和pPIC9K

提供客户：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

服务周期：1周

·步骤2. P. Pichia表达菌株电转化：

     酶切线性化表达质粒。
     将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中。
     利用蛋白酶去除不需要的纯化标签（Tag），再纯化获得所需的目标蛋白（可选，构建表达载体时需加入合适的蛋白酶切位点）。
     通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
     可提供表达菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。

提供客户：PCR阳性克隆及PCR结果报告。

时间：1周

· 步骤3. P. Pichia表达菌株筛选：

     将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
     SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。
     如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。

提供客户：任意一个客户需要的阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

时间：2周

·步骤4. P. Pichia表达菌株表达优化：

挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达zei好菌株优化表达条件。
对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。

提供客户：任意三个客户需要的阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。

时间：2周

·步骤5.目标蛋白表达及纯化：

     摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白。
     通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
     通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制zei终产品质量。
     通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

提供客户：纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的zei终蛋白，纯度zei高可达90%以上。

时间：2~3周

备注：

     1. 如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果zei终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用（给予客户20%~50%折扣）。
     2. 如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
     3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们zei终根据实际情况将给客户提供zei少1mg，zei多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
     4. 我们提供的zei终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证zei终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照zei大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
     5. 每次Western-blot检测zei多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。