免疫印迹（western blotting，WB)实验服务项目

免疫印迹（western blotting，WB)是一种结合了SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和敏感性来检测蛋白的方法。其采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE分离蛋白质样品，然后将蛋白转移到固相载体（例如***纤维素薄膜）上，然后再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或***自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

免疫印迹的流程： 
1. 蛋白质的抽提
2. 蛋白质定量
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE）
4. 蛋白质转移至***纤维膜
5. 膜的封闭和一抗抗体孵育
6. HRP标记二抗孵育
7. 加入ECL发光剂，暗室曝光，胶片显影

蛋白样品制备

做 WB 之前，蛋白质的提取至关重要，成也提取败也提取。

相关步骤如下：

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取

1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。详细信息>>

SDS－PAGE 电泳

电泳开始，相关步骤如下：

 一、清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。详细信息>>

转膜

相关步骤如下：

1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的***纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的***纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。

要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里。详细信息>>

封闭及一抗二抗孵育

在做杂交时，个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，这样节约抗体。

相关步骤如下：

1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色（2 %乙酸、0.5 %丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。详细信息>>

暗室胶片曝光
 

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1．用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间；2．将膜在 PBST 或 TTBS 中洗涤 30 min 或更长，期间至少换 2 次液。详细信息>>
 

western blotting(WB)服务须知： 
1. 样本要求尽可能新鲜；
2. 样本量：组织样本，质量大于100mg；细胞样本，细胞数大于1×106；
3. 您可自备一抗，也可让我公司代买。为保证质量，抗体zei好为进口单克隆抗体；
4. 服务时限和内容：收到样本之日起20-30个工作日内提交实验结果，具体包括实验方法、步骤、所用试剂、仪器、图片及相关分析数据等；
5. 报告提供：实验结果将以电子或书面形式提交给您。