CLIP- Seq，即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（crosslinking-immunoprecipitation and high-throughput sequencing），是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术。该技术主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR等步骤，再对这些分子进行高通量测序和生物信息学的分析，从而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。
       最近几年，这项技术也被应用到miRNA靶标鉴定等工作中。在动物体内，成熟的单链miRNA与一系列蛋白形成miRNA诱导的沉默复合物（RISC），结合于靶mRNA的3"-UTR 区，阻止所结合的mRNA的翻译或直接降解靶miRNA。基于这一原理，我们可以通过CLIPSeq技术来进行mRNA靶基因的筛选。CLIP-Seq方法的应用能够非常明显地降低miRNA结合位点的假阳性预测频率，并且减小miRNA结合位点搜寻空间的范围，可以在全基因组范围内鉴定AGO2蛋白在不同RNA上的结合位点。

1、实验方案
      测序策略：Illumina平台 SE50
      数据量：20M clean reads

2、技术优势
（1）全转录组覆盖：与CLIP芯片相比，可在全转录组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定；
（2）高灵敏度：每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究转录组上稀有的蛋白结合位点；
（3）准确性高： 从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间相互作用；
（4）特异性强： 紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，只会鉴定出蛋白和 RNA 之间的相互作用；
（4）应用范围广： 特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。

3、数据分析
（1）将reads比对到基因组：将预处理reads与reference genome进行mapping，最后得到mapping的sam结果文件，给出mapping结果统计；
（2）peak detect：应用sam文件进行peak富集区查找；
（3）motif detect：查找结合位点区结构特性，寻找转录因子结合区域的motif结构；
（4）基因关联：应用结合位点区位置，确定其周围所涉及的基因；
（5）关联基因GO差异分析：以参考基因组为背景集对结合位点关联基因进行GO富集分析。

4、技术流程


5、案例分析
       案例（1）依赖SIRT7去乙酰基的U3-55K蛋白控制的rRNA前体加工
        SIRT7是一种NAD+依赖蛋白脱乙酰酶，在核糖体合成及细胞增殖中具有重要作用。以往的研究已经证实SIRT7与RNA聚合酶I 相关联，它与pre-rRNA相互作用促进rRNA合成。德国肿瘤研究中心小组成员通过研究表明SIRT7也与小核仁RNP相关联，参与pre-rRNA的加工和rRNA的成熟，实验通过将标记的SIRT7从紫外交联的HEK293T细胞中进行免疫沉淀，然后获取沉淀RNA进行测序，最后进行序列分析。敲除SIRT7会损害依赖U3 snoRNA的早期断裂步骤，而这一步对18sRNAde 生成是必不可少的。从机制上来看，SIRT7脱去乙酰基U3-55k，它是U3 snoRNA复合物的一个核心成分，这个可逆的乙酰化作用调节U3-55k与U3 snoRNA的结合。SIRT7的脱乙酰作用促进U3-55k与U3 snoRNA的结合，是pre-rRNA进行加工的先决条件。在压力条件下，SIRT7从核仁被释放，导致U3-55k高度乙酰化，减弱pre-rRNA的加工。结果显示SIRT7在核糖体合成中具有多种作用，调节rRNA的转录和加工。

图1 SIRT7与pre-rRNA和snoRNA关系图
       案例（2） ALS相关蛋白TDP-43、FUS和TAF15功能的异同
       肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种以运动神经元、脑干和脊椎渐进性退化为特点的绝症。本研究展示了RNA代谢过程中FUS、TAF15和TDP-43的功能异同。RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）TAF15、FUS和TDP-43与ALS有关。为了比较三个RBP的功能差异，本文运用CLIP-Seq和RNA Bind-N-Seq技术对成年小鼠脑进行研究，揭示TAF15可富集得到约4900条含有GGUA基序的RNA。TAF15与FUS在内含子中表现出相似的结合模式。但是不同于FUS和TDP-43，TAF15在差异性剪切中仅起到微小的作用。在人的神经祖细胞中，TAF15和FUS会影响靶RNA的稳定性。源自人干细胞分化得到的运动神经元细胞中，TAF15和FUS同时缺失的RNA图谱与ALS患者纤维母细胞中FUS R521G突变展现出相似的结果。

图1 TAF15对一个转录本小子集差异性剪切的影响
参考文献
[1] Chen et al. SIRT7-dependent deacetylation of the U3-55k protein controls pre-rRNA processing.Nature Communications, 2016.
[2] Kapeli et al. Distinct and shared functions of ALS-associated proteins TDP-43, FUS and TAF15 revealed by multisystem analyses. Nature Communications, 2016.