扩增子测序是对特定长度的PCR产物或捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。16S/18S/ITS等扩增子测序即通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，以研究环境微生物多样性及群落组成差异。16S/18S rDNA为编码原/真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。ITS分为两个区域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。
实验流程图：

样本要求：Total RNA 10µg
案例展示：
1、各样品组的物种相对丰度柱状图

Alpha 多样性分析

Rank-abundance 曲线可用来解释多样性的两个方面——物种丰度和均匀度。在水平方向，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线越平缓，物种分布越均匀。


Rank-Abundance 曲线            alpha 多样性指数箱线图
4、Beta Diversity 是对不同样品的微生物群落构成进行比较分析。通过Beta-diversity分析可以直观地反映样本的差异情况。距离越远，微生物群落差异越大，即相似性越低。
  
    Unweighted UniFrac PcoA         weighted UniFrac PcoA 

β多样性箱形图
5、差异检验
物种间的差异分析可以通过OTU聚类的不同进行，从火山图，热图和曼哈顿图可以直观地表现物种间的差异。



                                                    差异OTU 火山图                                                                                                                                               差异OTU 热图
曼哈顿图
 

LEfSe分析根据分类学组成对样品按照不同分组条件进行线性判别分析, 从而能够在组与组之间寻找具有统计学差异的物种, 即对样品划分产生显著性差异影响的Biomarker 物种。

通过LDA得分图可直观的反应出不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的显著性。而物种分支进化图，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。

                   LDA 得分图                                                                                          物种分支进化图