实验技术服务-体外转录与逆转录

 
 
体外转录
概述
 
      体外转录是指在含有RNA转录酶、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞系统中，，模仿体内转录过程以DNA为模板转录生成RNA的技术。
 
实验流程
 
（1）制备DNA模板：PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但必须使用线性化的DNA，且保证DNA模板中没有RNase，在用作模板前采取胶回收的方法回收质粒DNA以纯化DNA模板。
（2）体外转录：加入反应体系 → 60℃水浴去除模板中的RNase → 冷却后加入T7 RNA 聚合酶，37℃保温2h → 70℃加热10min灭活T7 RNA聚合酶 → 电泳检测转录效果
（3）去除DNA模板： 用等体积的含有RNase-free DNase的Tris饱和酚-氯仿抽提，加入0.1 倍体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇，高速离心去上清，加入75%的乙醇振荡，高速离心去上清，用DEPC水溶解RNA。
 
  
结果展示
  
逆转录
概述
 
      逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。逆转录需逆转录酶的催化。人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。
 
实验流程
 
（1）TRlzol法提取RNA
（2）RT-PCR反应
（3）RNase H酶处理
（4）PCR扩增成稳定的双链DNA 
  
实验结果