在lncRNA的机制研究中，除了我们在lncRNA整体研究方案中提到的ceRNA作用模式外，还有一种作用模式是lncRNA与蛋白结合（通常是转录因子），然后将蛋白复合物定位到特定的DNA序列上，影响某基因的表达，进而影响相关疾病的进展。

       下面我们通过对一篇文献的解读来阐述一下lncRNA与蛋白相互作用的调控机制（The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer. [J]. J Clin Invest. 2017 Aug 14. pii: 94233. doi: 10.1172/JCI94233. IF：12.574）

       这项研究成果发现：lncRNA在FOXN3-NEAT1-SIN3A转录因子调控网络中起“桥梁”作用，从而促进乳腺癌的发展。研究者利用RNA免疫共沉淀和高通量测序的方法鉴定了一个雌激素诱导的lncRNA（NEAT1），NEAT1在转录因子FOXN3和SIN3A的相互作用中起到桥梁作用，这是一个经典的蛋白-lncRNA-蛋白的作用模式。ChIP-Seq和深度测序还揭示FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物能抑制GATA3基因的表达，从而促进体外乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程，在体内能促进乳腺癌细胞的扩散和转移。有趣的是，他们还发现 FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物能反向抑制自身活性，在转录调控中形成一个负反馈环。FOXN3-NEAT1-SIN3A与癌症的不良预后有关。下图是文章作者发现的NEAT1参与的ERα-NEAT1-FOXN3/NEAT1/SIN3A-GATA3轴在雌激素依赖型乳腺癌中的作用（ERα：estrogen receptor-α ）。

       这篇文章的研究思路和代表性图片如下：

       一、机制研究：这一部分也是让这篇文章过10分的关键

1、通过亲和纯化和质谱分析发现乳腺癌细胞中转录因子FOXN3和SIN3A发生共表达。

2、通过免疫共沉淀、免疫印迹和快速蛋白液相色谱法发现FOXN3和SIN3A在ER阳性乳腺癌细胞中发生相互作用，在ER阴性乳腺癌中没有相互作用。

3、假设FOXN3和SIN3A之间要靠DNA或者RNA来促进相互作用，通过在免疫共沉淀实验中加入DNase和RNase A，发现在ER阳性乳腺癌细胞中加入DNase时FOXN3和SIN3A还发生相互作用，当加入RNase A时FOXN3和SIN3A不再发生相互作用，说明FOXN3和SIN3A的相互作用要在RNA分子存在的情况下才能发生。

4、通过RNA免疫共沉淀偶联高通量测序（RIP-Seq）的方法，利用CIMS和Piranha二次计算得到该RNA分子可能为lncRNA（NEAT1或MALAT1），随后lncRNA microarray的结果发现NEAT1在ER阳性乳腺癌细胞中的表达高于ER阴性乳腺癌细胞，而MALAT1在ER阳性和ER阴性乳腺癌中的表达量相差不大，说明在转录因子FOXN3和SIN3A的相互作用中起重要作用的是NEAT1，而不是MALAT1。

5、qPCR显示雌激素（E2）能促进NEAT1的表达，正好解释了上述lncRNA microarray发现的NEAT1在ER阳性乳腺癌细胞中的表达高于ER阴性乳腺癌细胞。

6、通过CHART-Seq技术找到FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的转录靶点，通过qChIP和RIP-qPCR发现 FOXN3和SIN3A能调控GATA3，TJP1，NCOA2和TLE1的表达，这些基因与癌症的EMT和侵袭相关。

7、RNA结合位点（RBRs）预测发现NEAT1结合到SIN3A的SAP18上。

8、通过ChIP-Seq和CHART-Seq 分析发现ERα是FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的转录靶点，从而得到ERα-NEAT1-FOXN3/NEAT1/SIN3A-GATA3的负反馈环。

       二、通过体内外功能实验验证FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的功能。
 

       FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的体内外功能研究，包括EMT相关蛋白的检测，transwell侵袭，肿瘤动物模型中癌细胞的肺转移检测等。

       三、临床样本和生物信息学分析验证。

       通过癌症病人肿瘤组织的免疫组化和公共数据库的Kaplan-Meier存活分析研究FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物与癌症等级及不良预后的关系。

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