双荧光素酶报告基因（Dual-luciferase reporter gene ）实验
 双荧光素酶报告基因实验介绍Dual-luciferase reporter gene assay introduction

       萤火虫和海肾荧光素酶都具有快捷、 简便、 灵敏度高的检测特点， 被公认为是理想的报告基因， 因为它们具有完全不同的进化起源、酶学结构和底物要求。 萤光素酶报告基因的测定需要用光度计或多功能微孔板检测仪， 且发光强度与荧光素酶的数量成正比。

       萤火虫荧光素酶（Photinus pyralis） 已被证实是检测启动子活性和监测基因转录后调控状态的理想的报告基因。 它是在细胞质中作用的酶， 分子量为 61 kDa并催化下列反应 ：

                                                          

        海肾（Renilla reniformis） 荧光素酶是一个 36 kDa 单亚基蛋白质， 酶活性不需要翻译后修饰， 因此它可以作为一个实时转录报告基因，催化下面的生物发光反应：

                                                            

       此体系可以在目的基因的附近监控顺式作用元件的转录激活。 然而， 它很难通过基因3’UTR调节来测定转录抑制效率， 因为酶底物的活性非常低。 在测定底物抑制物时， 酶底物复合物的稳定性有更大的灵活性。 由于生物学变异和其它原因的干扰， 使观察到的荧光素酶活性差异变小， 所以在标准实验流程中通常会选择一个报告基因作为内对照， 使另一个报告基因的检测均一化。 标准实验流程也需要调整转染效率和细胞活性之间的差异。

 

双荧光素酶报告基因检测流程

1. 重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；
2. 细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；
3. 共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；
4. 外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；
5. 细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；
6. 荧光检测: 使用Thermo酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测；
7. 数据分析。

 双荧光素酶报告基因实验的优势

 

1. 优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；

2. 内源性低，哺乳动物无内源性表达；

3. 荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；

4. 发光检测，检测方便；

5. 灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；

 

双荧光素酶报告基因的主要应用领域

1. 潜在启动子/启动子核心区域检测；

2. 潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；

3. 启动子区可能的转录因子结合位点检测；

4. 启动子/增强子与转录因子的相互作用；

5. 病毒/细胞相互作用；

6. 药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；

7. 射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。

 

双荧光素酶报告基因服务说明

1. 客户提供报告基因质粒，或者客户提供基因名称由HYY构建表达质粒。
2. HYY 提供报告基因质粒、数据分析结果、瞬转细胞图片和说明实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的实验报告一份。
3. 实验周期2～3 周左右。