实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR,RT-qPCR)简称定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)。qPCR 是在 PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,在PCR反应体系中加入荧光基团,通过检测荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或者内参基因对未知模板进行定量分析。qPCR可用于mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA等的定量检测。
qPCR包括染料法和探针法两种。染料法qPCR是利用荧光染料与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加,如SYBR Green I。SYBR Green I与DNA双链结合时发出的荧光强度是有游离时的1000倍。探针法qPCR是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,如Taqman探针。Taqman 探针长度为 20-24 bp, 在其 5’末端标记一个荧光报告基团, 3’末端标记一个荧光淬灭基团, 其序列与PCR扩增产物内的一段 DNA完全互补。探针完整时,荧光报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针降解,使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离,从而淬灭作用被解除, 荧光信号释放。染料法简便易行,成本较低;探针法则由于增加了探针的识别步骤,特异性更高。
1、合成引物、标记探针。
2、提取样品的RNA。
3、检测RNA的浓度和纯度。
4、RNA电泳检测。
5、除去RNA中的DNA。
6、反转录合成第一链cDNA。
7、配置反应液,上机检测。
8、qPCR产物电泳检测。
9、数据分析。
RNA电泳图
扩增曲线
溶解曲线
qPCR产物电泳图
1、客户提供样品。
细胞≥10^5个,组织≥100 mg(黄豆粒大小),全血≥0.5 mL,血浆≥2 mL,基因组DNA≥5 μg。检测指标多余10个需要提供更多样品。
建议所有样本干冰寄送,保持低温环境,保证样本质量。
2、HYY提供RNA电泳图、扩增曲线、溶解曲线、qPCR产物电泳图、原始数据、数据分析表、柱形图和说明实验过程中所用的耗材、仪器设备、实验方法的实验报告一份。
3、实验周期1~2周。样品和指标较多适当延长实验周期。