原位杂交服务
简介:
原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH)简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
基本要求:
1. 组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是:
1)保持细胞结构;
2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;
3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性:
1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。
2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。
3)蛋白酶处理:蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露,以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K),还有链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
4. 杂交缓冲液孵育:
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr,以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,达到减低背景的目的。
5. 防止污染:
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套,实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤(180℃)以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
6. 双链DNA探针和靶DNA的变性:
杂交反应进行时,探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时),双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应,不然解链的探针又会重新复性。
赛尔生物实验流程:
1. 预实验摸索实验条件;
2. 预实验成功的情况下,按照预实验确认的实验条件开展正式实验;
3. 实验结果采图;
4. 结果交付。
客户提供:
1. 液氮保存或多聚甲醛固定的样本;
2. 石蜡切片或冰冻切片;
3. 探针(亦可在我司定制)。
最终结果:
1.具体试验流程(包括:实验步骤;主要仪器及试剂说明(含仪器厂家、型号;试剂厂家、批号));实验原始图片等。
2.实验组和阴性、阳性对照切片,各实验组的数码照片。
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