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重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP)
原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧***位点被胸腺嘧***所替代,而甲基化的胞嘧***位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。
特点:
1、特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;
2、灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程
A. DNA制备
用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B.重亚硫酸盐处理
C. DNA纯化
用Wizard DNA clean?up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D. PCR扩增
E. PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化
F. PCR产物连接到pMD19?T (Takara) 载体中克隆及测序。
G.用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析