甲基化特异性的PCR实验（methylation-specific PCR, MSP）

    原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。

该方法优点是：

1、  检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；

2、   快速、简单，省时；

3、  如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。

MSP技术实验流程

A．DNA抽提

用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B. 重亚硫酸盐处理

C．DNA纯化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D．DNA脱磺基反应

E．甲基化特异性的PCR反应

针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。

实例：

检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物

M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp

U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp

PCR扩增结果图