方案标题： 差示扫描荧光法表征蛋白配体互作

检测样品：热休克蛋白Hsp90，醛脱氢酶1A1 (ALDH1A1)

检测项目：蛋白小分子Thermal shift assay

应用领域： 制药

 

方案摘要

差示扫描荧光法（DSF），也被称为thermal shift assay（TSA），是表征蛋白热稳定性的常用方法之一，广泛应用于蛋白配体互作表征，突变体、缓冲液、去垢剂筛选等领域。DSF可以通过荧光染料或蛋白内源荧光信号监测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（折叠蛋白与去折叠蛋白相等时的温度）。

方案详情:

染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，蛋白去折叠疏水区暴露时，疏水染料SYPRO Orange便会结合至该区域，荧光强度增加（图1）。无标记DSF则是基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测（图2）。

图1. 染料法DSF

图2. 无标记DSF

当配体的结合增强蛋白稳定性时，其熔解温度Tm也会升高。如下图所示，未加入ATP时，Hsp90 蛋白的Tm为63.46℃，在加入ATP后，结合增强了Hsp90蛋白的稳定性，Tm升高至67.53℃。因此我们可以利用该方法进行蛋白结合活性的快速验证或高通量配体定性初筛。

图3. PR蛋白稳定性分析仪表征蛋白配体互作

在进行蛋白配体互作表征时，染料法DSF存在一定的局限性。外源加入的染料结合至蛋白可能会直接影响蛋白的稳定性或干扰蛋白与配体的结合，并且在蛋白形成聚集时，染料会发生解离，不适用于多结构域蛋白的检测。例如醛脱氢酶1A1 (ALDH1A1)在用SYPRO Orange染料检测时仅有一个热变性峰，并且在加入辅因子NAD+和已知的抑制剂NCT-501后并没有出现明显的Tm变化（图4a）。而使用PR蛋白稳定性分析仪进行无标记DSF检测时，ALDH1A1呈现出两个热变性峰，在加入辅因子NAD+后，第一个热变性峰明显右移。继续加入抑制剂NCT-501后，第一个热变性峰消失，蛋白稳定性增强（图4b）[1]。

图4 ALDH1A1 DSF检测对比

此外，染料法DSF的实验操作较繁琐，需要根据蛋白的特性及去垢剂兼容性选择合适的染料，优化蛋白和染料的比例，在配制样品时还要考虑染料自带的有机溶剂对蛋白的影响。而用PR蛋白稳定性分析仪进行无标记DSF实验时，稀释好样品就可以直接上机检测了。

除了无标记DSF（nanoDSF）检测模块外，PR蛋白稳定性分析仪还可搭载动态光散射（DLS），静态光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模块，只需要10μl样品就可以完成均一性，热稳定性，胶体稳定性的检测。我们还提供自动化解决方案，便于客户进行无人值守的高通量筛选。

图5 机械臂自动上样的PR蛋白稳定性分析仪

[1] Labrou N E . Targeting Enzymes for Pharmaceutical Development Methods and Protocols: Methods and Protocols[J]. Methods in Molecular Biology, 2020.