在本白皮书中，我们介绍了使用 NanoSight Pro 开发的细胞外囊泡 (EVs) 的荧光标记和检测方法，以及指导这些方法实施的代表性数据。 我们使用来自尿液的 EVs，通过光散射和荧光分析评估其大小分布和浓度。 采用多种荧光染料和荧光基团，我们不仅证实了 EVs 的存在，而且还有 效地检测了其表面和内部 RNA 货物上的四次跨膜蛋白生物标志物。

　　细胞外囊泡（EVs）因其不断发展的应用和突破而引起了人们越来越大的探索兴趣，特别是在疾病诊断和治疗潜力领域[1]。这些由活 生物体内的细胞产生的微观生物物质最初被认为是细胞废物。然而，研究揭示了它们在细胞间通讯中的关键作用。 细胞外囊泡是一个通用术语， 其亚型有许多定义，包括根据尺寸范围进行分类：小 EVs（<200 nm）和大 EVs（>200 nm）。外 泌体是小 EVs的一种亚型，与源自质膜的 EVs 相关[2]。 从体液中提取的细胞外囊泡伴随着非 EVs 成分，形成了一个相当多样化和异质的系统，这对分析表征提出了重大挑战 [2]。重要的 EVs 表征包括尺寸和尺寸分布，这可以提供有关其来源和纯化方法有效性的信息。释放的 EVs浓度的变化可以表明细胞通讯的增加， 使其具有诊断潜力 [5]。准确表征 EV s制剂的大小、异质性和浓度可为分析、了解生物功能和诊断提供重要信息。

　　 EVs 含有多种分子，如蛋白质、脂质和核酸（包括 RNA 和 DNA）。 EVs 的组成，包括其货物分子，可以反映其来源细胞的生理或病 理状态。这一特性使得 EVs 成为一系列疾病的生物标志物，从癌症到神经退行性疾病和炎症性疾病[4]。迄今为止， 还没有公认的 EVs 或 EVs 亚型的通用分子标记物 [2]。尽管在所有 EVs 中并不常见，但研究中广泛使用的值得注意的生物标志物是四次跨膜蛋白 （包括 CD9、CD81 和 CD63），因为它们积聚在小EVs 的表面而不是细胞裂解物上 [5]。四次跨膜蛋白是完整的跨膜蛋白，复杂地参 与细胞外囊泡生物学的各个方面，包括生物发生、货物分选以及与受体细胞的相互作用。由于它们在许多EVs 亚型表面的丰度很 高，它们被认为是最容易用于研究的生物标志物，通常用于 EVs 分析并作为特定的外泌体标志物。因此，能够检测这些生物标志物 在EVs研究中具有相当重要的意义[6]。 此外，检测和量化 EVs 内部 RNA 的能力同样重要，因为它为了解 EVs 的诊断潜力和用于治疗的成功封装提供了宝贵的见解。分析 EVs内部的 RNA 货物可以揭示其在细胞内通讯和疾病过程中的作用，同时也有助于标准化和质量控制[7]。

　　NanoSight Pro 已成为一种有价值的工具，越来越多地用于 EVs 表征，因为它能够跟踪单个颗粒的尺寸、尺寸分布和浓度测 量， 并且其荧光模式有助于通过荧光标记检测外泌体。本白皮书阐述了如何使用 NanoSight Pro 探索各种标记方法，以揭示 EVs 的不同特性。 使用荧光 NTA 检测 EVs 亚群是通过遵循一些简单的规则来实现的，这些规则涉及染料特性（例如光稳定性和亮度）、样品制 备方法（例如抗体亲和力和特异性、孵育条件）和测量条件（例如样品呈现、仪器设置、测量时间）。 首先，尿液来源细胞外囊泡（EVs）的尺寸、尺寸分布的异质性和浓度被有效地表征，作为对照测量。其次，使用两种具有 不同光稳定性的荧光染料（CellMask™ Orange 和 ExoGlow™）证明了膜标记的成功。两种染料均表现出大约 100% 的标记 效 率，证实了尿液来源 EVs 的存在和纯度，并展示了 NanoSight Pro 准确测量荧光信号的能力，甚至能够检测来自像 Exoglow 等光漂白染料的荧光信号。然后使用两种不同的染料 Alexa Fluor® 488（488 nm 激发波长）和 Pe/Cyanine （488 或 532 nm 激发波长）开发了生物标志物检测方法。两种染料都证实了 CD9、CD63 和 CD81 生物标记物的存在，由 于两种染料之间的不同特性，Alexa Fluor® 488 有更高的荧光标记效率。最终，使用 Quant-iT™ RiboGreen 染料成功建立 了 EVs 携带的货物的检测方法，RNA 标记效率达到 52%。 

　　总而言之，正如广泛证明的那样，NanoSight Pro凭借其特殊的荧光模式，在推进细胞外囊泡 (EVs) 用于诊断和治疗的研究和 开发工作方面拥有无限的能力。