利用冰冷的CaCl2 制备competent cells以传统方法进行质体的转形。仪器用具:37℃培养箱;42℃水浴;冰浴药品试剂:0.1 M CaCl2置冰浴中2 M glucose:取18 g glucose溶于水中,并调体积至50 mL,无菌过滤,分装后置 -20℃贮存。2 M Mg2+:取20.3 g MgCl2 · 6H2O及24.65 g MgSO4 &mi
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%~5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:
讲述细胞转染技术分类并分别介绍各种转染方法的原理、应用、特点及各种转染方法的比较. 常规转染技术可分为两大类一类是瞬时转染一类是稳定转染(永久转染).前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中因此一个宿主细胞中可存在
脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体(DOTMA)和(DOPE)的混合物。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。