凝胶柱的选择

在选择凝胶柱时，从外观、质地结构和性能来讲，所选柱子要透明光滑，内径一致，耐压防腐，柱子物料须生物兼容，并有良好的物理化学抗性和稳定性。一般的柱材料多为玻璃或有机玻璃，在使用钢柱时，特别要注意防腐蚀。另外，柱子终端要有采集器和过滤网，柱底板要求耐压且不容易堵塞。死体积应小于0.001Vt，如果死体积过大，被分离组分可能会重新混合，导致洗脱峰出现拖尾现象，降低分辨率。底板过滤介质要求新，且带有能与凝胶融合的网孔，避免接触网孔和过滤介质的表面，因为指纹会使样品的分离程度下降。在装柱或重新装柱时，所有部位必须彻底清洗干净。

凝胶柱的长度和内径主要取决于加样体积的多少和对分辨率的要求。凝胶柱的长度对分辨率的影响较大，长柱的分辨率要比短柱的高，但过长会引起柱内不均一、流速过慢，柱长度一般不超过100cm。同时，也要有适当的柱内径，内径过粗会产生蛋白样品较为严重的横向扩散现象，内径过细，靠近柱内壁的流速会大于中心的流速，产生“器壁效应”，影响分离速度和效果。通常使用的凝胶柱长度在25-70cm，内径在4-16mm，H/D（高径比）一般在 （25:1）-（100:1）之间。用于组别分离的凝胶柱，其H/D 可相对低一些；进行分级分离时H/D可在（30:1）-（100:1）；而脱盐柱由于对分辨率的要求较低，一般用短柱，H/D大多在（5:1）-（25:1）之间。如果要分离的蛋白质分子量相差较大，可选用H/D=（15:1）-（50:1）的柱子，且柱体积要大于4-15倍的样品体积；如要分离的蛋白质分子量差异较小，则选用H/D=（20:1）-（100:1）的细柱，且柱体积要大于25-100倍的样品体积。在纯化蛋白质时，为了得到较好的分辨率，柱子的H/D 应在（20:1）-（40:1）。

此外，选择柱子时还应考虑凝胶颗粒的大小。如填装小颗粒凝胶，适合使用较大直径的色谱柱；用粗颗粒填装时，则用较小直径的柱子。

凝胶的预处理

市售凝胶一般呈干粉颗粒状（如 Tandex） 或水悬浮状 （如Tanrose CL）。一些不宜在脱水干燥状态下保存的凝胶 （如琼脂糖凝胶），应存放在含防腐剂的水溶液中，这些凝胶在使用前不需要进行溶胀处理。另外，多孔硅胶和多孔玻璃也不需要溶胀处理。为了尽量减少不同溶剂对柱床体积的影响，获得理想的分离效果，应将干胶缓慢倒入5-10倍干胶体积的洗脱液中充分溶胀。若溶胀不够，则达不到有效的分离，而且在使用过程中会引起凝胶柱破裂。

根据蛋白质样品的分子量和分辨率要求选择好所用凝胶的类型后，再根据柱体积和凝胶的吸水性质估算出干胶的用量。由于凝胶在预处理和实验操作过程中有一定量的损失，所以在实际称取时应高于理论计算值的10%-20%。

不同类型的凝胶所需的溶胀时间不同。一般型号较小、排阻ji限较低的凝胶，其吸水量较低，溶胀所需时间较短，在20℃条件下需3-4h即可；型号较大、排阻ji限较高的凝胶，其吸水量较大，故所需的溶胀时间也较长，在20℃左右需十几小时到几十小时。

加热溶胀是常用的凝胶预处理方法，即把所称量的凝胶干粉溶在洗脱液中逐渐加热至接近沸腾。这种方法可大大缩短溶胀时间，一般在1-2h内即可完成，而且可起到溶胀、除气和杀菌的三重效果。在凝胶溶胀过程中要不断缓慢搅拌，但不能剧烈搅拌，因为这样容易引起凝胶颗粒的破碎，zui终使细小颗粒堵塞凝胶柱而影响到流速和分离效果。此外，还应尽量避免在酸或碱中进行加热溶胀，以防破坏凝胶的网孔结构。

待充分溶胀后，应将凝胶匀浆悬浮，看上清中是否有杂质或不均一的细小颗粒，如有则需反复倾倒去除，直至上清液不再浑浊为止。对溶胀后的凝胶进行除气泡是非常重要的，否则也会影响分离效果，一般可通过真空抽气或加热煮沸的方法排除气泡。由于凝胶价格昂贵，在使用过程中要尽量减少损失和浪费，剩余凝胶要保存好，以备后用。

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