简介

聚合物和脂质纳米颗粒已被广泛用作递送siRNA和mRNA的载体。我们总结了纳米粒子电荷和可电离性在与RNA复合、与生物成分结合、从内体逃逸以及将RNA释放到细胞质中的关键作用。强调了纳米颗粒的表观pKa对其有效性和毒性的重大影响，以及在开发用于RNA的主要配方中优化pKa的重要性。我们还讨论了在纳米粒子中微调pKa的可行性，以及该方法在优化RNA递送系统中的应用。

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基于RNA的治疗药物的给药系统

RNAs正在迅速发展成为一类新的用于可成药分子包括蛋白质、RNA和基因组的治疗策略。。尤其是用siRNAs和mRNAs可用于治疗多种疾病已经引起了广泛的关注。siRNAs是一种21-25bp的双链非编码RNA，能诱导细胞质中目标mRNAs的特异性切割。siRNAs相对较小，分子量约为14 kDa，而mRNAs是长的单链RNA，分子量范围从300 kDa到5000 kDa。siRNAs是化学合成的，而mRNAs是通过体外转录合成的。在进入细胞后，mRNAs表达编码的蛋白质，以产生快速但短暂的治疗效果。与传统的基于病毒载体的疫苗相比，mRNA疫苗产生的抗原对免疫系统而言更加自然，因而诱导更佳的T细胞反应。

基于RNA的疗法非常有前景，因为它们不需要核转运，而且与基于DNA的药物相比，突变风险较低。应将完整形式的siRNAs和mRNAs送入靶细胞以发挥其治疗作用。然而，负电荷和RNA的大小阻碍了它们进入细胞。此外，裸露的RNA在人体内很容易受到RNA酶降解和肾脏清除的影响。外源RNA也可以被先天免疫系统检测到并触发免疫反应。因此，一个高效和安全的递送系统对于将基于RNA的疗法从实验室转移到临床是至关重要的。

纳米粒子的化学修饰和包埋是克服体内生物屏障的常用方法。纳米颗粒已经被广泛地用于递送质粒DNA、寡核苷酸和RNA。带正电的纳米材料与阴离子RNA形成纳米颗粒，以保护RNA不受核酸酶的影响，并帮助结合和穿透带负电的细胞膜。然而，需要克服的两个主要挑战是内体逃逸和RNA从纳米颗粒中解离。

在不同类型的纳米材料中，脂质和聚合物因其安全性、灵活性和效率而成为最常用的运送RNA的纳米材料。纳米颗粒的大小、形状、表面电荷、比表面积、电离常数和聚集性是决定纳米颗粒的有效性和安全性的关键特征。因此，这些特性的优化对于开发成功的RNA纳米颗粒配方至关重要。

含有可电离胺基头部的纳米颗粒是一种很有前途的RNA递送平台。酸解离常数(pKa)是纳米粒子可电离头基最重要的物理化学性质之一。pKa决定了纳米粒子的电离和表面电荷，这极大地影响了它们的稳定性、效力和毒性。它们的生物学性能取决于阳离子纳米颗粒与带负电荷的血液蛋白和细胞膜的相互作用。此外，表面电荷影响纳米颗粒的细胞摄取、内体释放和生物分布。

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表观pKa-基础知识和测量技术

表观pKa是由实验确定的分子或纳米颗粒的值。该值是体系中电离(质子化)基团和非电离基团数目相等时的pH值。根据表观pKa可以估计纳米粒子中组装的纳米材料的表面电荷和离子相互作用。纳米粒子的表观pKa是纳米粒子中所有电离基团和去离子基团的平均比率的结果。因此，表观pKa不是任何单个分子的内在pKa值。随着pH值的降低，纳米颗粒的可电离胺基从去质子态转变为质子态。这一转变在表观pKa值附近非常迅速地发生。

表观pKa值受各种非共价相互作用和环境参数的强烈影响，如离子强度、介电常数、疏水相互作用、π-π堆积相互作用和相邻电荷的存在。此外，可电离配体修饰的纳米粒子的表观pKa值随纳米粒子的大小和形状而变化。这些结构和环境因素会影响纳米粒子的实际电离。因此，纳米颗粒的表观pKa通常低于纳米颗粒中单个分子或单体的pKa。

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表观pKa的测定

纳米颗粒的表观pKa可以用不同的技术来测量。酸碱滴定法和2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光法是测定空白纳米粒表观pKa的常用方法。在酸碱滴定(又称电位滴定)法中，首先将空白纳米颗粒悬浮在0.1M盐酸溶液中，然后加入0.1M氢氧化钠或0.5M氢氧化钾溶液进行滴定。滴定曲线两个等值点中点对应的pH值即为pKa值。TNS荧光法非常灵敏，已被广泛用于测量LNPs的pKa。TNS在水溶液中是非荧光的，但在与阳离子脂类或聚合物结合并移动到疏水环境中后显示出强烈的荧光。随着pH值的降低，TNS和可电离表面的相互作用增加，导致了荧光的稳定增加。在特定的pH值下，所有的可电离基团带电荷，荧光值达到最大。进行TNS荧光试验前，首先准备一系列的pH值在3-10的buffer溶液（150mM的NaCl，10mM的硼酸溶液，10mM的磷酸溶液，和10mM的柠檬酸溶液）。制备空白纳米粒，并且稀释在每种溶液中。TNS溶于DMSO中，浓度为300μM，将2μl的TNS溶液玉100μl的空白纳米粒混合。测定激发光325nm，发射光435nm条件下的荧光值。图1B展示了荧光值与pH值之间的曲线。

图1. pKa测定方法原理图

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基于纳米粒子的RNA递送中的表观pKa

表观pKa值反映了纳米粒子的电荷相互作用，这显著影响了它们的生物活性，因为纳米粒子的带正电荷的分子可以与体内带负电荷的蛋白质和细胞相互作用。带负电荷的RNA通过静电相互作用与可电离的阳离子纳米材料缩合形成纳米颗粒，从而保护RNA免受核酸酶降解。具有最佳pKa的纳米粒子在生理pH值时携带微量的电荷，从而防止体内非特异性结合和毒性。此外，纳米粒的最佳pKa在内体逃逸和RNA释放到胞浆中以发挥治疗效果方面发挥重要作用(图2)。毒性，低效的内体逃逸，以及细胞质中纳米颗粒与RNA的不充分解离是与纳米颗粒的电荷状态相关的主要挑战，这些挑战可以通过调节表观PKa来克服。因此，表观pKa是提高包裹RNA的纳米颗粒效率的最重要参数。

图2.通过可电离纳米颗粒的内体逃逸将RNA输送到细胞质中

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脂类纳米粒在siRNA传递中的表观pKa

脂质纳米粒( LNPs )是目前临床上最先进的RNA递送系统。LNPs由可电离阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇( PEG ) -脂质和胆固醇的混合物组成。虽然可电离脂质是LNPs的主要成分，也是最重要的成分，但其他成分也会影响LNPs的稳定性和功能。

通过系统地改变1，2-二苯氧基-3-二甲氨基丙烷(DLinDMA)的结构，采用合理的设计方法开发了MC3脂质。每条尾巴上的两个双键是DLinDMA高基因沉默活性的原因。脂类的饱和程度影响LNPs的相变温度。尾部的双键数量从0增加到2，降低了相变温度，增强了脂类的融合性。后来，在DLinDMA的linker中引入了一个缩酮环，从而开发了DLin-K-DMA脂质，使其沉默活性提高了2.5倍。通过在缩酮环和可电离的胺之间引入额外的亚甲基，进一步提高了活性，得到了DLin-Kc2-DMA(Kc2)类脂。开发高效脂质的另一种方法是筛选一个大的类脂分子组合库。

种种研究表明，调节LNPs的pKa可以用来实现细胞特异性活性。细胞摄取的增加并不总是与沉默活动的增加相关。LNP在进入细胞之前不应该解离，它们必须逃离内体，以完整的形式释放siRNA，才能产生沉默效应。基因沉默活性与pKa的相关性比与颗粒大小和siRNA的包封率更高。pKa值在6-7的LNPs展现了良好的基因沉默，而pKa在3-6的LNPs的稳定性和细胞摄取效率较低，导致沉默效率更低。

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用于mRNA递送的脂质纳米粒的表观pKa

与传统疫苗相比，开发基于mRNA的疫苗要快得多，使我们能够迅速对病毒爆发做出反应。最初设计用于siRNA递送的LNP可以被修饰以递送mRNAs。例如用于siRNA递送的C12-200 LNP，改变脂质比例和结构对其进行优化，优化后的LNP表达mRNA的能力相比原来的LNP增加了7倍。除了表观pKa外，两种LNP具有相似的形态特征，优化后的LNP的表观pKa从7.25变为6.96。有趣的是，这两个LNP在siRNA传递中显示出相似的效力，突出了siRNA和mRNA优化配方参数的差异。

表1.用于RNA递送的高效脂类和聚合物

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用于RNA递送的聚合物纳米粒子的表观pKa

各种阳离子的、可电离的、可生物降解的和电荷可变的聚合物已被用于制备用于有效递送RNA的纳米颗粒。聚合物的物理化学性质(尺寸、表面电荷、稳定性、包埋性和毒性)可以通过改变可电离基团或改变聚合物的大小来优化。

聚乙烯亚胺(PEI)因其内体逃逸能力而被广泛用于DNA和RNA的输送。胺的质子化在早期的内涵体中产生质子海绵效应。然而，PEI在生理条件下带有正电荷，它与生物分子的相互作用会导致显著的毒性。因此，已经用各种生物材料对PEI进行了修饰，以降低其毒性。壳聚糖是RNA递送中另一种性质良好、用途广泛的聚合物。壳聚糖可通过调节分子量和脱乙酰度，调节pKa在6.2 ~ 7.0之间。由此可见，壳聚糖基纳米粒在递送siRNAs和mRNAs方面是安全有效的。而且，由于壳聚糖的每个亚基都有两个羟基和一个胺基，因此可以很容易地对壳聚糖进行改性，以满足RNA递送的具体要求。

研究了广泛应用于RNA递送的三嵌段共聚物中pKa与siRNA递送效率之间的关系。通过调节疏水胺单体的数量和类型，合成了一系列pKa值在5.2~7.0之间的三嵌段共聚物。pKa为5.8~6.2的共聚物具有较好的基因沉默效果。

pH响应型聚合物是另一种很有前途的RNA载体。pH响应是可电离基团可逆去质子化和质子化的结果。pKa是反映纳米粒子在不同pH值下的电离状态的重要参数。具有最佳pKa值的纳米颗粒通过对内体pH的响应显示出最大的疗效。由该聚合物制成的siRNA纳米颗粒在体内表现出优异的抗癌活性。在纳米结构中保持最佳的pH敏感性对于产生最大的内体逃逸和RNA效率是非常重要的。

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纳米颗粒的pKa调节

聚合物纳米粒子的表观pKa可以通过对单体进行化学修饰、改变共聚物中不同单体的摩尔比或改变聚合物的相对分子质量来调节。通过控制不同单体的聚合，可以合成另一系列聚合物。纳米探针的急剧pH变化与其表观pKa密切相关。

LNPs的表观pKa不仅取决于单个脂类的pKa，而且还取决于所有脂类的摩尔比。每种脂类都有不同的pKa，可以通过改变其头基和疏水尾部来改变。因此，调整LNPs表观pKa的一个策略是对脂类进行化学修饰。另一种策略是使用两种或两种以上具有不同pKa值的脂类的混合物，并调整它们的比例，以获得所需的表观pKa。

结束语和未来展望

RNA治疗成功的关键要求是克服RNA到达作用位点前可能降解的细胞外和细胞内屏障。虽然纳米粒子被广泛用于保护RNA不被降解，但是纳米粒子的包封是限制治疗效果的主要瓶颈。内体逃逸还没有完全被理解，它因细胞类型的不同而不同。

pKa对纳米颗粒的不稳定性、效力和毒性的影响

人们普遍认为，纳米颗粒的结构和物理化学性质在递送RNA方面起着重要作用。然而，有效递送RNA的结构要求并不是决定性的，而且大多数活性脂质的结构特征非常不同(表1)。相比之下，纳米颗粒的表观pKa是预测纳米颗粒包裹RNA效率的可靠标准。纳米粒的表观pKa与其疗效和毒性有很高的相关性。表观pKa在最佳范围内的纳米颗粒显示出有效的内体逃逸和治疗效果(图2)。将表观pKa作为纳米粒子开发的设计标准将有助于发现有效和安全的RNA疗法。优化pKa值为6.2-6.5的LNPs被发现对肝脏递送siRNAs是有效的。最佳pKa在6.6-6.9范围内的LNPs在IM注射mRNAs后产生非常有效的免疫反应。不同细胞的内吞过程不同，因为细胞的增殖状态因其生理作用而不同。表观pKa应根据靶组织和疾病情况进行优化。

总体而言，最佳的pKa值取决于几个因素，包括载体的结构、靶组织和递送途径。因此，很难推荐一个普遍的pKa值的纳米粒子用于RNA传递。但是，pKa值6-7是开发用于RNA疗法的纳米颗粒的理想范围。

文献来源：Patel et al. The Importance of Apparent pKa in the Development of Nanoparticles Encapsulating siRNA and mRNA. Trends in Pharmacological Sciences, 2021, 42(6): 448-460.

领域：核酸药物,生物制药/仿制药