详细介绍：

好消息，青莲客户又喜提高分文章啦! 近日，Medicinal Chemistry杂志收录了中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所宋丹青导师和汪燕翔导师合作的题为“Berberine Directly Targets the NEK7 Protein to Block the NEK7−NLRP3 Interaction and Exert Anti-inflammatory Activity”的研究论文。该项研究首次证明NEK7是BBR治疗炎症相关疾病(如2型糖尿病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝和神经退行性疾病)的主要直接靶点之一。在这次发现过程中，小青展示出了相当“硬核”的朊实力呦，担任了文章中LC-MS/MS检测工作。我们一起来看看吧！

研究思路

结果速递

1.评估BBR对IL-1β分泌的抑制作用

建立LPS（含有Nigericin）处理PMA-THP-1（人单核细胞系-1）细胞促进其分泌IL-1β模型。通过Western印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了上清液和裂解液中BBR对Caspase-1裂解和IL-1β分泌的时间和剂量依赖性抑制作用（图1：a/b/c/d），结果显示：BBR对IL-1β的分泌表现出中度抑制作用（在BMDM中），IC50值为5.1μM（图1：e），并且在浓度高达40 μM时，未观察到细胞死亡或凋亡（图1f-h），表明BBR的抑制作用与细胞毒性无关。

图1  BBR对PMA-THP-1X细胞中IL-1β分泌的抑制作用

2.直接靶蛋白的筛选与鉴定

文章选用了Compound-8d和Compound-15d分别作为阳性/阴性探针，进行蛋白质组靶向筛选，验证BBR对IL-1β的作用。通过LC-MS/MS分析鉴定的得到了75个蛋白质，其中有10个是酶，其余的是核糖体蛋白、剪接体、微管蛋白等。与15d处理相比，8d处理在25-37 kDa之间检测到一条明显的条带(图2：c)，通过链霉亲和素珠富集和免疫印迹实验进一步证实分化条带为NEK7蛋白(图2：g)。并且验证了8d与重组蛋白NEK7的特异性结合，也发现NEK7也能被BBR竞争性抑制(图2：f/h)。如图2J所示，BBR对NEK7激酶有中度抑制作用，IC50值为4.2μM，与先前对IL-1β释放的IC50结果一致。在SPR分析中，BBR还与固定化的NEK7呈现剂量依赖性结合，Kd值为15.6μM(图2：k)。

图2  蛋白质靶向BBR标记

3.NEK7与−NLRP3相互作用中的BBR机制

通过免疫共沉淀(Co-IP)实验检测了BBR对NEK7和NLRP3之间相互作用的影响。NEK7的R121残基正好位于NEK7和NLRP3之间相互作用的关键区域之一，如图3：a所示，在293细胞中，BBR剂量依赖性地抑制了NEK7-NLRP3的相互作用，这在PMA-THP-1细胞中通过内源性Co-IP分析进一步显示（图3：b）。相反，没有亚甲二氧基的O-BBR不能阻断NEK7-NLRP3的相互作用(图3：c)，BBR未能抑制它们之间的相互作用，而在293细胞中，121-精氨酸被突变为丙氨酸(图3：d)。R121-A的单点突变可以极大地限制了NEK7与NLRP3之间的相互作用，从而抑制NLRP3炎症小体的活化以及随后一系列包括IL-1β在内的炎症因子的释放。

图3  BBR阻断NEK7和NLRP3的相互作用

4.BBR抑制NEK7的体内验证

为了验证NEK7作为体内BBR对抗炎症的靶标，作者建立了NEK7敲除小鼠模型以评估BBR对IL-1β产生的影响。试验通过用腺病毒AdV转染小鼠10d后，每隔12h给予BBR治疗3次，然后LPS刺激。结果发现，小鼠经静脉内注射Adv shNEK7感染10天后，与对照组相比，NEK7的表达明显降低（图4：b）；BBR明显减少了对照组的IL-1β产生（图4：c），而NEK7基因未见明显变化。用BBR治疗的基因敲除组，表明BBR对IL-1β的NEK7依赖性作用。这些结果表明，由于NEK7抑制与其他机制协同作用，BBR发挥了体内作用。

图4   BBR在体内通过NEK7抑制IL-1β

结论

本文基于ABPP的化学蛋白质组学策略，首先确定了NEK7是BBR抗炎的一个重要的直接蛋白质组学靶点，并阐明了BBR通过与NEK7上关键的R121残基的氢键特异性地阻断NEK7−NLRP3的相互作用来发挥其抗炎作用，正是这种非共价键使得BBR只表现出适度的抗IL-1β激活的效力，从而缓和了抗炎活性。这一结果有助于以NEK7为靶标实现新型NEK7–NLRP3相互作用抑制剂的开发。

小檗碱直接靶向NEK7蛋白阻断NEK7−与NLRP3的相互作用并发挥抗炎作用

期刊名称：Journal of Medicinal Chemistry

IF：6.205

样本选择：无特定病原体的C57BL/6J的小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、HEK-293T和L929细胞、THP-1细胞

取样策略：探针标记、Pierce Streptavidin磁珠纯化

技术策略：WB、ELISA、PCR、Co-IP、LC/MS

领域：多组学/蛋白质组/代谢组/脂质组