在过去的几年里，单细胞分子方法，如RNAseq (sc-RNAseq)已经彻底改变了我们对分子细胞生物学的理解。单细胞分辨率已被证明是极其重要的，特别是在癌症生物学，我们都知道肿瘤由多种不同的细胞类型组成，并且每种细胞都有不同的功能，他们相互协同作用。类似地在哺乳动物器官中，如造血系统是各种细胞类型的复合体，不同细胞复杂的相互作用决定了健康或疾病状态。虽然sc-RNAseq方法提供了大量生物系统中RNA景观的信息，并具有很高的临床相关性，但它们的读书并不能平行的反映蛋白的表达水平。蛋白质是细胞的重要组成部分，并且作为生理功能的主要承担者，具有非常重要的研究意义。近期液相色谱质谱(LC-MS)为基础的蛋白质组学方法的进展，促进了质谱技术在单细胞蛋白质组学(scMS)发展，使得大规模研究单细胞蛋白质组学不再是遥远的梦。

近期，丹麦哥本哈根大学健康科学学院Finsen实验室发表题为“Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchies”研究成果，展示了其实验室建立的一个实验工作流程，允许对单细胞蛋白质组进行全局表征，而不依赖于抗体进行蛋白质鉴定，并在AML异质性进行了验证，其方法能够有助于基于质谱的蛋白质组学定量方法成为大规模单细胞蛋白组学分析的工具。

实验工作流程

图 1 实验工作流程

首先，单个细胞被FACS分类到包含裂解缓冲液的384孔PCR板的单个孔中(图1 c, d)。工作流程中的一个重要特征是记录每个细胞的FACS参数(称为索引排序)，并在数据分析过程中对其进行整合。此外，与ScoPE2的一个关键区别是，作者使用的是基于三氟乙醇(TFE)的裂解缓冲液，包括还原和烷基化试剂，而不是纯水。考虑到这种试剂细胞裂解比纯水产生更多的蛋白质，特别是利于肽的鉴定。接下来，细胞通过板内冷冻和煮沸进行裂解，然后进行过夜消化，使用16 plex TMTPro技术标记单细胞。127 C是空通道用于消除booster通道126同位素杂质污染。Booster通道是将500个细胞分选到384孔板的每个孔中，随后采用与单细胞样本相同的预处理步骤。剩余14个通道分别标记5个LSC、5个 progenitors, 4个blasts .将不同通道样本进行脱盐混合后，进行上机检测。对于LC-MS分析，我们使用了一个标准的纳升级液相，相对低流量(100 nl/min)和一个3小时的液相梯度方法，与Orbitrap Exploris™480质谱连用，并结合FAIMS Pro。该设备不仅可以过滤污染的+1离子(即非肽污染物)，而且还能实时切换，在多个补偿电压(CV)之间，分离出不同的离子(即肽)种群，从而显示出更大的肽群和蛋白质组深度，此外，通过降低每个馏分的复杂性，降低共分离干扰水平。

结果速递01scMS检测AML细胞异质性

首先作者验证新搭建的实验和计算工作流程鉴定OCI-AML8227异构性的能力。作者使比较了“高（IT=500ms）”和“中”（IT=300ms）数据采集模式，发现两种方法都能很好地分离分化阶段(图2a)。然而，“高”方法在分离功率(轮廓系数)方面优于“中”方法(图2b)。在所有蛋白质(图2c)和丰富的蛋白质(图2d) 数据统计中，“高”数据集显示更高的数据相关性。对于s/n较低的蛋白质，差异倍数的准确性降低(图2e)，在整个动态范围内，“高”方法优于“中”方法。这些结果表明，作者的工作流能够有效地处理多种scMS数据，这使得OCI-AML8227模型系统中已知的分化阶段得以分离。

图2 两种方法检测细胞异质性

02从scMS数据中提取生物信息

将FACS得到的CD34和CD38表面标记物的强度叠加到每个细胞上，表明scMS数据可以通过分离三个分化阶段重现FACS分析的观察结果，同时能简单分离CD38+和CD38-细胞 群(图3a，细胞分化阶段的成功分离，以及接近完美的重复出FACS分析定义的细胞分布(即CD34/CD38荧光团水平)，鼓励作者进一步研究不同细胞组之间的差异蛋白表达。作者使用了校正后的蛋白质表达矩阵，而忽略缺失值，将blast细胞与其他细胞进行了比较，结果发现blast细胞和合并组（LSC & progenitors）的差异表达(DE)蛋白LSC和progenitors细胞(图3b)。差异表达蛋白的基因富集分析显示，在LSC和progenitors细胞中，与蛋白质翻译和髓细胞分化相关的通路被富集。有趣的是这些DE蛋白在不同的细胞分化阶段表达不均匀，表明我们的单细胞组学数据捕获蛋白表达的逐步变化差异(图4 c)。综上所述，这些结果表明蛋白表达量的变化驱动了细胞不同的分化阶段，作者的工作流程能够揭示分化进程中蛋白质水平的变化，这具有重大意义。

图3 单细胞组学数据生信分析

分析讨论

本文主要介绍了使用基于液相质谱的蛋白质组学方法分析白血病细胞异质性。作者构建AML模型系统中，能够使用蛋白质组学数据与FACS数据联合分析。虽然此项研究只是单个白血病细胞，但其构建的单细胞组学检测工作流程是后续研究的良好资源，并为研究原发性白血病和其他血液相关疾病铺平道路。并希望这种方法继续打开一个单细胞蛋白组学研究新途径，跨越许多生物领域。随着仪器灵敏度和实验工作流程的进一步发展，蛋白质组的覆盖率将会继续提高，进一步缩小单细胞转录组与蛋白组之间的覆盖率差距。

领域：多组学/蛋白质组/代谢组/脂质组