想要研究外泌体，首先分离外泌体是必不可少的步骤，外泌体因其特殊结构，在分离纯化方面面临很多挑战。广泛外泌体分离常用的方法是超速离心法，根据细胞、细胞碎片、外泌体的密度和大小不同进行分离，耗时长，多达8-10个小时；免疫亲和方法根据外泌体的特异性进行分离，如CD63, CD81, CD9。同样存在加工时间长(4-20 h)、重现性差等缺点；尺寸排阻法根据外泌体和蛋白溶液粒径大小不同进行分离，这种方法更利于大量外泌体制备，但是由于外泌体浓度较低，不利于后面科研实验研究。

在这种情况下，迫切需要新的外泌体分离方法，能够快速有效地分离出纯度高的外泌体，因此，我们引进了新型的富集材料TiO2，一种能特异性结合磷脂双分子层囊状结构的新型武器新

新型分离武器的正确打开方式

液体上样首先使用0.22微米的滤膜过滤，去除细胞碎片和较大细胞外囊泡，然后与TiO2孵育，清洗3次，将外泌体洗脱下来，进行后续实验（电镜、NTA、WB、蛋白组学质谱检测等等）。

新型分离武器技能描述

1.电镜确证

扫描电镜观察到的TiO2是粒径5微米的球，表面是干净光滑的，与样本孵育之后清洗杂质之后，球表面附着了无数的100nm粒径的小囊结构。经过透射电镜观察确证这些富集到的颗粒有典型的cup-shaped 结构。

2.免疫确证

使用外泌体表面特异性的抗体，如TSG101、CD81对富集前后TiO2进行免疫荧光实验。如图所示，在TiO2微球的表面观察到较强的荧光信号，在对照组样本中只有很小的荧光。证明TiO2富集到了外泌体并且只有结构完整的外泌体才能被富集。

3.NTA电镜确证

从TiO2上洗脱下来的外泌体经过了透射电镜和NTA分析，在洗脱液中典型的杯状结构依然完整，表明在分离和洗脱过程中，磷脂双分子层结构依然保留。NTA分析结果显示TiO2分离的外泌体大小分布在65 ~ 235 nm之间，中心位于133nm。

新型分离武器华山论剑

1.鉴定数量比较

超速离心法和外泌体试剂盒法是市面上常用的外泌体分离方法，将TiO2分离法与其他两种方法进行了多角度的比较。对使用三种方法分离出来的外泌体进行了质谱鉴定，分析发现TiO2法鉴定384个蛋白，远高于其他两种方法（超离228个蛋白，试剂盒252个蛋白），与超离相比，提升了40%的蛋白鉴定率。三种富集方式分别鉴定到外泌体蛋白为307（TiO2）, 171 (超速离心)和 187（试剂盒法），TiO2法独有的190个蛋白中有144个蛋白是ExoCarta 外泌体数据库中报道过的外泌体蛋白，127个蛋白定位在外泌体，进一步证明TiO2分离外泌体的可靠性。

2.蛋白富集比较

对鉴定到的蛋白进行GO分析和DAVID功能聚类分析发现，TiO2鉴定到的蛋白中，外泌体蛋白的富集度，这表明TiO2富集的外泌体纯度高。

3.常见污染蛋白比较

挑选了18种典型的外泌体标记物，它们是外泌体中常见的前100种蛋白质(ExoCarta)。以超离心得到的相应蛋白量为参考，归一化后，得到18个外泌体标记物数量的对数倍差值。

TiO2法和试剂盒法提取的大多数外泌体标记物的数量明显较高(对数值为正)，血清中的污染物，即白蛋白(ALB)、IgG (IGHG1-IGHG4)、IgA (IGHA1和IGHA2)、触珠蛋白(HP)和转铁蛋白(TF)，在TiO2富集样品中的含量明显低于试剂盒法和超离样品(图中为负对数值)

4.回收率和实验时间比较

评估了从血清样本中分离外泌体所需的回收率和分析时间，包括超速离心、密度梯度离心、粒径排阻层析，超速离心，免疫亲和法以及聚合物沉淀法。外泌体回收率在5分钟内达到80%，与已发表的其他方法相比，TiO2法是有效的血清外泌体分离方法。

结论

综上所述，基于外泌体与TiO2的特异性相互作用的新型分离武器，具有回收率高，重现性好、污染少的优点，它能洗脱分离出完整外泌体结构，也可以直接裂解用于下游蛋白质组分析，与传统的方法相比，基于TiO2的外泌体分离方法是一种简单、快速、高效的血清外泌体研究方法。

领域：多组学/蛋白质组/代谢组/脂质组