细胞萤光素酶报告基因检测受多种因素影响，例如载体状态，细胞状态，转染量，转染效率，裂解效率，加样精度等等，因此实验中一般需要做3个或以上复孔，且最好采用双萤光素酶报告基因，以保证实验结果的可信度。现将双萤光素酶实验检测中常见的问题汇总如下：

Q1:如何选择载体？

萤火虫萤光素酶一般选取pGL-3、pGL-4或pmirGLO的载体，也可自己构建相应的载体；

海肾萤光素酶一般选取phRL-TK或pGL-4载体，建议不使用强启动子（如SV40，CMV），而选取中等强度的启动子

Q2:检测结果萤光值过低或无萤光值怎么办？

多种情况均可导致检测结果萤光值过低或无萤光，具体原因和解决办法如下：

1,启动子活性低

a.优化细胞的培养条件，提高萤光素酶的表达量；

b.更换强启动子（如SV40、CMV）。

2,转染效率低

a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达萤光蛋白质粒）；

b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；

c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。

3,样品裂解效率低

a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解；

b.加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。

4,检测过程操作不规范

a. 选择合适的检测仪器，如Luminometer 发光计、多功能酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验；

b.需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；

c.保证室温反应。酶促反应对温度较为敏感，反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温（20-25℃）再使用；

d.萤光素酶的体外半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成；

e. 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号。

5,底物氧化失效

a.底物避光密封保存，萤火虫萤光素酶底物-20℃保存；海肾萤光素酶底物推荐-80℃保存；

b. 反应工作液建议现用现配。

Q3:如何判断转染成功？

1，如转入的miRNA带萤光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞萤光；

2，如转入的miRNA不带任何萤光标记，可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达；

3，设置一个萤光质粒转染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。

Q4:细胞裂解物可以存放多久？

常温一般不超过6小时，-20℃可以保存一个月，-80℃可以保存半年。

Q5:萤光素酶作为报告基因相比于萤光蛋白有哪些优势？

萤光素酶的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要萤光显微镜，而且在活体实验中其萤光穿透性高于GFP等萤光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。而GFP等萤光蛋白相比于萤光素酶的优势在于可以进行示踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。

Q6:为什么我的实验复孔无法重复？

实验复孔有一定差异是正常的，通常只要在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围，则需要考虑以下2个方面，一是细胞裂解后离心取上清，保证样本均一性；二是保证加样的准确性，移液器要定期校准，确保移液精准。

Q7:检测结果萤光值越高越好么？

萤光值过高可能会超出仪器检测范围从而检测不到结果，一般读数在5-6之间较好，萤光值过高可通过减少质粒转染量或对裂解产物进行稀释后检测，不建议通过减少萤光底物来降低萤光值，因为底物饱和才能反映萤光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

萤光素酶实验的应用

萤光素酶作为报告基因技术的一种，具有快速、灵敏、准确的优点，常应用于以下几种生物学研究：

1，启动子活性分析：启动子区是RNA聚合酶的结合区，启动子的结构直接关系到转录的效率，萤光素酶实验可用于验证待测启动子是否有活性及其活性区域；也可实现组织特异性启动子筛选及确定；以及用于新顺式作用元件发现及功能鉴定。

2，启动子与转录因子的结合验证：将待检测的启动子序列构建在报告基因上游，同时在细胞实验中共表达转录因子，分析萤光素酶表达水平，即反映转录因子是否调控基因的表达，转录因子能增强或抑制启动子的启动能力。

3，验证microRNA与靶基因是否存在调控关系：microRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，microRNA大部分通过成熟体种子区与3’UTR结合抑制蛋白翻译。可以将目的基因3’UTR区域构建至报告基因luciferase的下游，再共转入microRNA，如果萤光素酶表达下降，可以说明microRNA对目的基因的抑制作用；

4，启动子SNP分析：单个核苷酸变异，简称SNP，通过构建萤光素酶报告基因系统研究SNP位点的增强子与转录因子是否结合最为直接。

5，分析信号通路是否激活：将待检测信号通路的下游相应元件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其萤光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。

CHASELECTION逐典萤光素酶报告基因检测试剂盒旨在准确、灵敏、高效地测定萤火虫萤光素酶活性，应用高通量药物筛选、药物活性检测、大规模启动子功能测定、信号通路等研究。

逐典萤光素酶报告基因

针对报告基因检测不同的侧重需求，逐典推出了3种检测系统。

逐典萤光素酶报告基因优势：

1. 检测灵敏度高，信号稳定性好

HEK293-NFK B-LUC细胞加入梯度稀释的TNF 在37C、5%CO条件下刺激6小时后,分别用增强型、超敏型、稳定型检测试剂进行信号检测。

2. 操作方便

仅需将底物和萤光素酶检测缓冲液混合后直接加入到细胞即可。

3. 稳定性好

同时在10次反复冻融实验中，逐典全系列报告基因检测试剂盒显示出较强的稳定性。

领域：细胞生物学