前  言

3月12日《中华人民共和国药典》（2020年版）第一增补本正式实施。此次增补涉及693个品种，其中新增品种47个，通用技术要求、指导原则6个；修订品种646个，通用技术要求15个。其中四部新增的9120氨基酸分析指导原则，首次明确了测定药品中氨基酸含量或氨基酸组成的氨基酸分析方法。

氨基酸是人体蛋白质的基本组成物质，除个别芳香族氨基酸外，紫外吸收均较弱，直接使用紫外检测器检测灵敏度低。故氨基酸分析通常需要选择合适的衍生试剂增加氨基酸的生色团，再使用紫外检测器进行检测。目前氨基酸衍生主要包括柱前和柱后衍生两种方法。

柱前衍生化的高效液相色谱法以其操作简单、分析速度快、灵敏度高等优点，成为药典中氨基酸的主要分析方法。常见的柱前衍生试剂有异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉-N-(羟基琥珀酰亚氨基)氨基甲酸酯（AQC）、邻苯二醛（OPA）、9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）和2,4-二硝基氟苯（DNFB）等。柱前PITC衍生氨基酸测定法分离效果好，方法技术成熟，适用于含氨基酸种类较多的样品分析。

本方案使用Chromai Leaps超高效液相色谱仪，采用柱前PITC衍生氨基酸测定法对氨基酸注射液以及氨基酸加锌口服液进行分析，测定结果和产品标示值一致，方法稳定可靠。

仪器配置

01仪器

Chromai Leaps高效液相色谱系统

Leaps四元泵（P40）

Leaps标准型自动进样器（A10）

Leaps 标准加热型柱温箱（C10）

Leaps紫外-可见检测器（D10）

02

色谱条件

Chromai Lotus C18（4.6*250 mm, 5 μm）(货号：3.1.04.0009)

流动相A：乙腈-0.1 mol/L醋酸钠溶液（取醋酸钠13.6 g，加水900 mL溶解，用醋酸调pH至6.5，加水至1000 mL）（7:93）

流动相B：乙腈-水（80:20）

检测波长：254 nm；

柱温：40 ℃；

流速：1 mL/min；

梯度洗脱：

时间（min）

流动相A（%）

流动相B（%）

0

100

0148515296634300

100

370

100

37.1

100

045

100

0

实验结果和讨论

01

标准溶液色谱图

PITC衍生氨基酸标准溶液谱图，如图1所示

图1 氨基酸标准溶液色谱图

02

线性范围及重复性结果

将不同浓度的系列标准工作溶液分别进样，得到并绘制标准曲线，在线性范围内，线性相关系数均大于0.999，且6针标准溶液保留时间和峰面积的重复性结果良好。

表1 线性范围及重复性结果

化合物名称

线性范围μg/mL

R^2

重复性

保留时间RSD%

峰面积RSD%

天冬氨酸

7.14~35.71

0.9994

0.089

0.337

谷氨酸

4.62~23.10

0.9997

0.084

0.336

丝氨酸

3.45~17.26

0.9999

0.099

0.163

甘氨酸

7.04~35.18

0.9999

0.095

0.204

组氨酸

5.62~28.10

0.9999

0.082

0.253

精氨酸

6.90~34.52

0.9998

0.063

0.265

苏氨酸

8.00~40.00

0.9998

0.045

0.245

丙氨酸

11.37~56.85

0.9998

0.046

0.256

脯氨酸

5.12~25.60

0.9998

0.023

0.382

络氨酸

2.96~14.82

0.9999

0.046

0.262

缬氨酸

6.12~30.60

0.9998

0.013

0.379

蛋氨酸

2.83~14.17

0.9999

0.023

0.280

异亮氨酸

3.19~15.95

0.9999

0.012

0.226

亮氨酸

11.90~59.52

0.9999

0.009

0.217

苯丙氨酸

5.95~29.76

0.9999

0.025

0.151

赖氨酸

14.86~74.29

0.9999

0.023

0.150

03

样品测试结果

对氨基酸注射液和氨基酸加锌口服液同样采用柱前PITC衍生法进行氨基酸测定，得到样品谱图如图2和图3所示，氨基酸测定结果与产品标示值一致。连续进样六针样品溶液，各氨基酸浓度结果RSD%均小于1%，方法稳定可靠。

图2 氨基酸注射液测试谱图

图3 氨基酸加锌口服液测试谱图

总结

采用Chromai Leaps高效液相色谱系统，搭配紫外检测器，采用柱前PITC衍生氨基酸测定法，16种氨基酸在线性范围内，线性相关系数均大于0.999。并对氨基酸注射液以及氨基酸加锌口服液进行分析，测定结果和产品标示值一致，且六针样品重现性测试中各氨基酸浓度结果RSD%均小于1%，方法稳定可靠。

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