关键词：MALDI-MSI 质谱成像，Cereals tissues 谷物组织 ，Sample preparation method 样品制备方法，Polyl -lysine(PLL) 聚-L-赖氨酸，Phosphatidylinositols (PIs) 磷脂酰肌醇

01

前言 

水稻和小麦是两种主要的谷类作物，富含氨基酸、脂质、膳食纤维、维生素、碳水化合物、矿物质和蛋白质等营养物质。其中，脂质是一类具有多种功能的疏水代谢物分子，它们不仅影响种子的自然(和人工)老化过程，还在能量储存、离子信号调节和细胞膜-膜生物合成等方面发挥着关键作用。然而谷物中含有的脂质结构极其复杂，可分为磷脂酰乙醇胺（PEs）、磷脂酰甘油（PGs）、磷脂酰肌醇（PIs）、磷脂酰丝氨酸（PSs）、磷脂酰胆碱（PCs）等，使脂质的综合分析成为一个艰巨的挑战。此外，目前对谷物脂质的研究主要集中于关注含量的变化，对脂质的空间分布研究还较少。因此，该研究旨在构建一种可靠、有效的 MALDI MSI 方法，来可视化水稻、小麦、青稞中的脂质代谢物的空间分布，以深入了解脂质的生物功能和精确分布，并为未来探索谷物老化机制和阐明谷物的营养价值提供有利依据。

02

摘要 

2022年8月，中国科学院兰州化学物理研究所师彦平团队在 Food Chemistry 发表了题目为“A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals”的文章，该研究通过比较不同的包埋介质和喷涂模式，优化了样品制备条件，最终开发了一种适用于硬干谷物中脂质成像分析的可靠有效的样品制备方法。并利用该方法结合 MALDI MSI 技术对不同存储年限的水稻和小麦进行了分析，揭示了水稻中脂肪酶对米糠和胚乳中脂质的水解情况，旨在为谷物中脂质的生物学功能和精确分布研究奠定基础。

03

实验设计 

本研究针对干硬谷物中脂质成像分析的样品制备问题进行解决，具体包括以下两个步骤：

1、样品制备方法优化：对样品浸泡溶剂、包埋剂以及样品黏附方法进行优化，最终建立了聚-L-赖氨酸（polyl -lysine, PLL）浸泡、导电胶带黏附、包埋介质固定的切片制备方法。

2、MALDI-MSI 方法优化：对 MALDI MSI 的激光直径/强度值、基质喷涂模式进行了优化，以获得最佳的质谱成像结果。

3.1

样品冷冻切片方法的评估

采用两种组织切片制备方法，对其质谱成像效果进行比较。

（1）水稻用四种不同的包埋介质：10%明胶溶液、1% CMC 溶液、OCT 和超纯水直接包埋。

（2）水稻首先用 1mg/mL 的 PLL 溶液在4℃浸泡6h，然后用上述包埋介质包埋。选择6个具有不同空间分布的代表性离子（m/z 为518.32、577.52、632.35、796.53、822.54 和895.72）对包埋方法进行评价，结果如图1所示。方法一制备的水稻组织切片胚乳严重破碎，并没有完全附着在导电双面胶带上，甚至胚胎的胚珠和外胚层也出现了不同程度的损伤。特别是在以 OCT 作为包埋介质时，麸皮很容易局部剥落，造成其他部分的污染，使成像不准确（图1a）。方法二制备的水稻组织切片具有完整的组织结构，在冰、明胶、CMC 和 OCT 作为包埋介质时，都没有出现卷曲、变形和破裂。此外，在 MALDI MSI 分析中，离子的信号强度并没有降低，也没有出现明显的 PLL背景干扰（图1b）。

图1. MALDI MSI 分析冷冻切片方法的评价

3.2

激光直径/强度值的优化

在 MALDI MSI 中，激光直径/强度值直接影响靶分子的信号强度，因此该研究比较了4种不同的激光直径/强度值（0/15、1/30、2/50、3/60）的成像结果，6个代表性离子的信号强度如图2a所示。随着激光直径/强度值的增大，离子的强度逐渐增大，然而，随着激光直径/强度值的继续增大，靶分子周围杂质峰的MS信号响应增强（图2b）。MALDI MSI 使用激光对组织切片表面的分析物进行解吸和电离，激光直径/强度决定了激光扫描样品的面积和分析物的数量，当激光直径超过目标分子的区域时，过量的激光强度会在同一像素处产生更多的杂质峰，从而干扰目标分析物的检测。因此，在后续的 MALDI MSI 实验中，选择最佳的激光直径/强度值为2/50。

图2. MALDI MSI 分析中激光直径/强度优化

3.3

基质应用方法优化

在 MALDI MSI 中，基质有助于提高电离效率和增强分子的信号强度，因此该研究对基质应用条件进行了优化，包括基质喷涂方式、基质溶剂组成、基质喷涂浓度和基质升华厚度。选择6种脂质 LPC（16:0）、PC（16:0/18:2）和 PC（18:1/18:2）、LPI(16:0）、PI（16:0/18:2）和 PI（16:0/18:1）分别以 9-AA、DHB 和 CHCA 为基质进行质谱成像分析。

首先对不同浓度的基质进行了比较，9-AA（5、10、13 mg/mL），DHB（5、10、20、30、40mg/mL），CHCA（5、10、20、30 mg/mL）。结果如图3a所示，脂质信号强度随 9-AA 浓度的增加而增加，最佳浓度为13mg/mL。如图S4a和图S4d所示，在30mg/mL DHB 和10mg/mL CHCA 时，脂质获得高信号强度。

然后对不同的基质溶剂组成进行了研究，结果表明，在 0.1% TFA 条件下，甲醇 : 水（70:30，v/v）对代表性脂类的喷雾效率和信号强度显著高于不加 TFA 的情况。接着对基质的不同升华厚度进行了测试。9-AA、DHB、CHCA 的最佳升华厚度分别为 0.9、1.5、0.5μm（图3b，S4b，S4e）。为了获得理想的脂质信号强度，该研究又进一步对基质喷涂模式进行了比较。结果显示，使用升华法时，9-AA、CHCA和 DHB 升华后在显微镜下均未观察到明显的结晶现象。而喷涂法与喷涂-升华两步法均出现了不同程度的结晶现象（图3c，S4c，S4f）。因此基质喷涂模式采用升华法。最后，又对不同的基质进行了比较，结果显示，虽然 CHCA 可以检测到比 DHB 和 9-AA 更多类型的脂质，但 DHB 在正电离模式下和 9-AA 在负电离模式下观察到更高的信号响应和更清晰的脂质 MALDI 成像。因此，选择 DHB 和 9-AA 实验基质（图3d，S6）。

图3. 基质应用方法优化（9-AA）

图S4. 基质应用方法优化（DHB、CHCA）

图S6.  DHB、9-AA 和 CHCA 作为基质时代表性脂质成像响应强度比较

3.4

水稻中脂质的MALDI MSI鉴定

利用上述方法，对水稻中的脂质进行了可视化分析。从水稻组织切片中获得了m/z 500-1000范围内丰富的脂质信号（图S7）。通过将准确的m/z 值和 MS 结果与脂质图谱数据库（https://www.lipidmaps.org/）进行比较，鉴定出23种脂质，包括了7种磷脂酰肌醇（PIs），6种甘油三酯（TGs），5种磷脂酸（PAs），3种磷脂酰甘油（PGs）和2种二甘油三酯（DGs），详细信息见表S1。

图S7. 水稻组织切片在正（a）和负（b）离子模式下的典型质谱

表S1. 正、负离子模式下水稻组织中脂质的鉴定

如图5b所示，水稻中脂质主要有两种空间分布模式。双甘油三酯（DGs）和甘油三酯（TGs）主要分布在水稻胚、麸皮和亚糊粉层中。此外，磷脂酰肌醇（PIs）、磷脂酸（PAs）、磷脂酰甘油（PGs）主要分布在麸皮和胚中，其中胚的含量相对高于其他组织。

图5. （a）水稻纵截面结构图 ；

（b）水稻组织切片中 DGs、TGs、PIs、PAs 和 PGs 的离子图像

3.5

该方案在小麦和青稞中的应用

为了进一步验证优化的样品制备方案的可行性，该研究利用新建立的 MALDI MSI 方法对小麦和青稞的脂质空间分布进行了分析。在m/z 500-1000范围内共鉴定出7种脂质化合物。溶血磷脂酰胆碱（lyophosphatidylcholine, LPC）在胚乳中含量较高，磷脂酰肌醇 （phosphatidylinositols, PIs）和磷脂酸（phosphatidic acids, PAs）主要分布在叶原基、胚芽鞘、盾片、糊粉层和外种皮中（S13b）。小麦和青稞组织切片中脂类的空间分布规律相似。该结果也证明了所建立的制样方案具有通用性，可有效应用于硬谷物和干谷物的 MALDI MSI 分析。

图S13. （a）小麦背侧和腹侧纵切面的光学图像（青稞的结构与小麦相似）；

（b）小麦和青稞组织切片中代表性脂质的离子图像。

3.5

不同贮藏年限水稻的MALDI MSI分析

水稻作为主要粮食作物之一，市场需求量逐年增加，然而，水稻在储存过程中不可避免地会发生老化，影响其营养价值和食用品质。利用上述建立的 MALDI MSI 分析方法对不同贮藏年份（2020年，1年；2018年，3年；2016 年五年；2015年，6年）的水稻进行分析。结果如图6所示，水稻胚乳中 LPC（16:0）的含量没有明显变化，而位于米糠和胚中的其他脂质（PI、PC 和 PG）的含量则随着贮藏年限的增加而逐渐降低。造成这一现象的原因可能是水稻中含有天然的脂肪酶和脂肪加氧酶，脂肪酶负责脂质水解，导致游离脂肪酸含量增加，而脂肪加氧酶导致不饱和脂肪酸随着时间的增加而氧化，导致水稻变质。

图6. 不同贮藏年限陈化大米的 MALDI MSI 分析

04

总结 

该研究建立了一种可靠、有效的 MALDI MSI 样品制备方法，可用于不同谷物中脂质的可视化。所建立的样品制备方案可以解决干硬谷物冷冻切片制备问题，保证成像的完整性。此外，利用所建立的成像方法进一步探索了不同贮藏年限下水稻中脂质空间分布的变化，揭示了脂肪酶更容易水解米糠和胚乳中的脂质，也表明了 MALDI MSI 是研究水稻老化的一种有效手段。这些结果不仅有助于深入了解谷物中脂质的生物学功能和精确分布，对于揭示脂质代谢物的类型、代谢通道、营养价值和生理功能至关重要，也为今后探索水稻老化机理、阐明谷物营养价值提供了有利的依据。

文献地址：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814622018738?via%3Dihub

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