2024-04-22 15:14
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反相色谱肽分离色谱柱和流动相研究
编译前言
ACD/Labs的中国AutoChrom软件用户最近期望ACD/Labs团队能够在反相色谱肽分离领域提供更多的知识和技术资源。为此我们编译了Patrick Peterson等人在2019年-2021年在色谱A上发表的系列文章共四篇供国内用户进行学习和参考。
这些文献是：
Investigation into reversed phase chromatography peptide separation systems part I: Development of a protocol for column characterization. Journal of Chromatography A Volume 1603, 11 October 2019, Pages 113-129
Investigation into reversed phase chromatography peptide separation systems part II: An evaluation of the robustness of a protocol for column characterization. Journal of Chromatography A Volume 1603, 11 October 2019, Pages 102-112
Investigation into reversed phase chromatography peptide separation systems part III: Establishing a column characterisation database .Journal of Chromatography A Volume 1622, 5 July 2020, 461093
Investigation into reversed-phase chromatography peptide separation systems Part IV: Characterisation of mobile phase selectivity differences. Journal of Chromatography A Volume 1641, 29 March 2021, 461986
这四篇文献首先介绍了他们团队开发肽反相色谱柱研究时色谱柱选择性判定的标定方案，该方法利用肽作为探针，表征反相色谱柱进行肽分离的选择性。这些肽探针通过探针的疏水性、静电性、氢键和芳香基团与固定相的相互作用，成功地区分了不同的色谱柱。
使用简化因子（Reduced Factor Design）设计评估肽反相色谱色谱柱表征方案的稳健性，以确定所需控制的程度。评估包括包括温度、流速、梯度滞留体积、梯度的变化、甲酸体系水相和有机相中的甲酸含量、甲酸铵体系的pH值和强洗脱中乙腈的量（%MeCN）， 发现其中的风险，为确保数据的完整性，引入了缓解措施，令使用肽探针对 反相色谱柱表征方案最终落地，形成了最终方案。
将方案拿来表征38种色谱柱。基于方表征案测试低pH值和中等pH值下的肽探针之间的保留时间差异，以计算选择性Delta值。探索正电荷或负电荷（脱酰胺）、空间效应（例如氨基酸顺序的外消旋以及序列颠倒）、氧化和芳香基团部分的增加/减少。统计分析表明，肽RPC色谱柱表征方案构建的色谱柱知识库可用于鉴定具有相似或不同色谱选择性的色谱柱，分别用于选择备用色谱柱或方法开发柱。
最后，对多种流动相组合进行了研究，对具有不同功能的肽探针表现出不同色谱选择性（即称为表征）的亚类之间的流动相组成进行了区分，从而揭示了多模式保留机制的可能性。利用统计学工具对所评估的各种流动相参数的相对重要性进行排序。为肽类分子质量研究提供策略上的技术支撑。
通讯作者Patrick Peterson 来自诺和诺德，肽类分析研究领域属于顶尖科学家，另一位作者Melvin R. Euerby则是色谱领域的思想领袖之一，他的很多科学著述帮助了一代代分析工作者提高了自己的知识，见识和能力。
本系列第一篇文章编译时为方便阅读，重新编写了文章顺序，第二三四篇则严格按照原文做了翻译，编译者水平有限，如果有所疏漏，请读者不吝指出，加以修正提高。
反相色谱肽分离系统研究
第一部分：色谱柱表征方案的开发
本文定义了一种方法，该方法利用肽作为探针，表征反相色谱柱进行肽分离的选择性。这些肽探针通过探针的疏水性、静电性、氢键和芳香基团与固定相的相互作用，成功地区分了不同的色谱柱，此外，还区分了更细微的相互作用，例如色谱柱分离外消旋或异构体探针的能力。肽的色谱选择性的主导力量似乎是疏水性，但其本质上是静电和极性。这凸显了对其他类型的色谱柱的需求，在肽的分离上这些色谱柱应具有混合模式官能团/静电/极性相互作用，而不是在小分子分离中占主导地位的疏水性。作者观察到不同色谱柱之间的选择性差异，但似乎是这些固定相的可及性差异在肽分离中起着至关重要的作用，即硅醇、疏水性乙腈/配体层或硅胶表面的薄吸附水层的可及性。
01
背景介绍
近年来全球生物制药市场不断扩大，市场份额大幅增加[1,2]。许多制药公司现在正在投入大量资源来开发生物分子，这是一个复杂而昂贵的过程。与小分子相比，肽和蛋白质由于其大小和物理化学性质的不同给分析方法研究带来挑战。因此需要一种不同的方法开发策略。有诸多文章主要根据疏水性和序列来预测肽的保留时间。这些预测基于对氨基酸侧链差异以及肽的二级结构的疏水性作用的理解[3-7]。还未有论文使用基于肽为探针的方法，表征和鉴定具有不同或相似选择性的色谱柱，以帮助开发方法。
开发将活性药物成分与其杂质和降解产物分离的方法非常具有挑战性，特别是通过外消旋作用产生的异构体，难以定性。由于异构体的质荷比相同，不能直接通过质谱法测定到异构体。因此，筛选选择性差异较大的色谱柱和流动相组合对于开发基于肽的药物产品的纯度方法至关重要。生物分子的色谱方法通常是根据过去的经验设计的。这种缺乏顶层设计的方法被证明是耗时的，而且对宝贵资源的利用率低。这与小分子分离相反，在小分子分离中，有各种关于使用不同固定相的小分子保留机制的文章，因此可以根据色谱柱表征方案的合理选择来制定方法开发策略和固定相选择[8-14]。
色谱柱表征是一个在受控色谱条件下使用定义明确的分子探针的过程，可以直接比较不同的固定相、制造商和色谱柱批次。对于小分子方法开发，有许多反相色谱（RPC）表征方案，这些方案已经产生了几个数据库，其中最大的是PQRI数据库中的Snyder疏水减法模型和ACD数据库中的Tanaka和Euerby等人的扩展方案，它们都可以在互联网上免费获得[9-13]。Lesellier等人基于线性溶剂化能关系（LSER）来表征超临界流体色谱法（SFC）的固定相[14]。不同的方案可以提供有关色谱柱的疏水性、空间相互作用、氢键能力和离子交换能力的信息。然而，目前尚不清楚基于小分子的色谱柱表征对于选择肽和蛋白质色谱柱的相关性如何。Hodges等人证实了这一点，他们得出的结论是，小分子PQRI数据库与一系列肽的保留之间几乎没有相关性。研究中的肽含有高比例的甘氨酸残基，以阻止任何“最近邻效应”，以便更深入地了解每个氨基酸与固定相之间的相互作用，并最大限度地减少高级结构，如α螺旋和β折叠[15,16]。本文的研究扩展了Hodge的初步工作，以研究更具生物活性的肽，这些肽可能会受到“最近邻效应”的潜在干扰。
本文作为本系列论文中的第一篇将描述一种基于肽的表征方案的设计，称为多肽反相色谱柱表征方案，该方案将研究影响反相分离系统选择性的因素，并协助开发合理的方法开发策略，使用为满足行业最佳实践而选择的流动相分离肽。目前包括固定相，但最终也将包括流动相组成。这将增加对肽分离选择性的理解，并研究一般机制，但也更具体地研究涉及降解和异构体物质的分离。表征方案可用于开发类似于小分子反相色谱的色谱柱表征数据库。数据库将有助于确定现有方法的备份色谱柱，并突出显示具有较大选择性差异的互补固定相组合，以便进行方法开发。
02
肽段的设计
本研究选择与人GLP-2相似的牛GLP-2作为碱基序列来研究固定相（表2）。其与生物制药行业相关，具有典型的链长并具有典型的降解位点。牛 GLP-2肽是一种有趣的探针，它不含半胱氨酸，因为半胱氨酸会由于二硫键的形成或断裂而限制肽的稳定性。
表2 牛GLP-2氨基酸序列表
牛 GLP-2肽链含有 33 个氨基酸，并具有形成二级结构的倾向，可形成 α 螺旋或 β 折叠。因此将GLP-2截断，将探针肽的长度减少到15个和18个氨基酸，以降低水环境中二级结构的可能性[21]。该长度与蛋白水解酶解后获得的长度相似[16]。在对应的色谱条件下，使用圆二色谱证实这些肽缺乏二级结构 [22]。牛GLP-2被分成亲水的片段（氨基酸1-15）和一个疏水的片段（氨基酸16-33）。使用两个碱基序列片段而不是单个肽将最大限度地降低二级结构的影响以方便研究单个氨基酸变化后的色谱柱的选择性。可以从保留和选择性方面来解释合成的肽探针与原片段的不同。本文总共合成了 26 个合理设计的肽探针来表征肽分离。肽序列中位置的改变和物理化学性质（即logP、pI和净电荷）如表3所示。
表3 肽探针列表以及其设计原理
牛GLP-2肽链包含多个常见降解位点，包括外消旋、异构化、氧化和脱酰胺化。外消旋化可以发生在形成 D-异构体的碳的手性中心，其中外消旋化速率可能取决于 pH 值、温度和溶剂等反应参数。这在丝氨酸和组氨酸中尤为普遍，已知丝氨酸和组氨酸在合成过程中易发生外消旋作用[23,24]。该序列为丝氨酸或组氨酸提供了四个外消旋位点（肽编号 2、6、7 和 14）。除了异天冬氨酸的异构化外，天冬氨酸还发生外消旋化，因此合成了另外 11 种类似物以探测外消旋和异构体降解物的分离（肽编号 3、4、5、9、10、11、12、16、17、18 和 19）。
肽的氧化可以通过链中第 10 位的蛋氨酸残基（肽编号 8）进行探索。在合成过程中或储存过程中，它很容易通过硫上的孤对电子以 1：1 的比例氧化成两种非对映异构亚砜。肽中酰胺官能团的丧失称为脱酰胺化。谷氨酰胺，特别是天冬酰胺[25,26]，当与甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸等氨基酸相邻时，在肽键和天冬酰胺侧链之间形成环状琥珀酰亚胺中间体，其可以通过水解形成天冬氨酸或异天冬氨酸的 D 和 L 形式。因此使用肽编号 9–12 探索了一系列脱酰胺、外消旋和异构化。
疏水性更强的肽链通常用于研究肽链某些点的特定修饰，目的是通过检查一系列修饰来更好地了解肽-柱相互作用（肽编号 13、15、20-26）。
空间相互作用比较轻微，但仍然是一个需要研究的内容。外消旋作用可以看作是空间相互作用的一种形式。其他研究的空间相互作用包括用亮氨酸（肽编号 13）取代缬氨酸和异亮氨酸（肽编号 20 和 21），它们的不同之处在于亚甲基和支链以及两个氨基酸的顺序互换（肽编号 15）。
改变肽的电荷会对其保留性产生重大影响，因其受到不同固定相、流动相组成和 pH 值的影响。通过用赖氨酸（侧链 pKa 10.35，肽编号 25）修饰位置 20 的精氨酸（侧链 pKa 12.48，肽编号13），可以研究相同电荷下极性和碱度微小变化的影响。在肽26中，也可以通过赖氨酸代替亮氨酸来研究从中性氨基酸变为带正电荷物质的影响。通过在链上的不同位置（肽编号 4、5、9、10、11、12、16、17、18 和 19）添加天冬氨酸来探测增加的负电荷带来的影响。
其他感兴趣的机制是芳香族和酚类效应，通过将亮氨酸换成苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸（肽编号分别为 22、23 和 24）来研究这些效应。小分子受芳香和酚类效应的影响很大，然而，不确定肽中单个氨基酸的变化将如何影响分离选择性，因为与小分子相比，这是肽的相对微小的修饰。Mant等人确实观察到一系列相似肽相差一个氨基酸[16,27]的选择性差异。然而，他们的肽在整个序列中有几个甘氨酸，其目的时防止二级结构带来影响。对于通常更具异质性的生物活性肽来说，情况可能并非如此。
03
色谱柱选择
所有评估的色谱柱都是制造商提供的新色谱柱，规格为 150 × 2.1 mm 色谱柱，粒径 （dp） 在 1.7–3 um 之间变化（表 1）。水峰顶点被用作每根色谱柱的死时间标记[17]。所有固定相均使用Tanaka和扩展表征方案进行评估，这些方案在文献中得到了很好的描述[9,19]，并且可以通过免费的ACD网站[11]访问。在使用前后应用系统适用性测试SST确保了固定相的完整性（第2.2.2节），SST评估了色谱柱的疏水性、氢键、正电荷和负电荷（硅醇活性）的变化。
表1 本研究选择的色谱柱以及其特征
固定相的选择基于对色谱柱的先验知识。本文固定相的选择性范围很广，可以代表更多的固定相，是表征数据库的理想选择。选择的一些色谱柱具有较大的带正电荷表面，而另一些色谱柱则具有高度的残留硅醇基团，以表征各种色谱柱官能团。在开发多肽方法时，通常不会选择这么多的色谱柱，但对于建立色谱柱知识数据库至关重要。本实验选择了一组基底硅胶有差异的C18色谱柱（Acquity BEH C18、Acquity CSH C18和Acquity HSS C18）。除了选择可以提供不同选择性的色谱柱外，研究固定相之间的相似之处也很重要，这样可以帮助选择备用色谱柱。此外，本文还评估了固定相的密度，该密度可能通过改变颗粒表面的结构来影响选择性，从而影响分析物对二氧化硅表面的可及性（即Acquity HSS C18 SB和Acquity HSS T3）。
本研究还选择了烷基长度的不同的色谱柱，以评估疏水性变化的影响，其中观察到的选择性差异可能被解释为链长差异（即Acquity BEH C4、Acquity BEH C8和Acquity BEH C18）。常用的色谱柱系列包括极性嵌入色谱柱（PEG）和苯基柱，它们可以提供替代的选择性。选择氨基甲酸酯配体色谱柱（Acquity BEH Shield RP18）和酰胺配体色谱柱（Polar Amide C18）来代表两种类型的PEG官能团，其中酰胺相通过两步合成路线制备，由于残留氨基而产生正电性特征，而氨基甲酸酯是一步合成路线，因此可以被认为是中性的。苯基柱（即Acquity CSH氟苯基、Acquity CSH苯基己基、Ascentis Express联苯和二苯基）因烷基接头（即C3-C6）、氟取代和芳环数量而异，这些都会影响与探针的相互作用。
用于开发表征方案的最后一种色谱柱是 Acclaim 混合模式 WCX色谱柱，这是一种基于羧酸基团的的弱阳离子交换的色谱柱。其固定相可以在低pH值下以不解离羧酸基团提供氢键相互作用，并在中等pH值下通过带负电荷的解离羧酸提供大量静电相互作用。这两种类型的相互作用都可能为极性肽和带电肽种类提供选择性。
04
缓冲液的设计，色谱条件和系统适用性测试
低pH值下的肽分析通常包括以动相添加剂之一：磷酸盐、三氟乙酸（TFA）、甲酸铵、醋酸铵或甲酸[28,29]。磷酸盐在生物制药行业中经常用于肽分离，因为它们通常提供良好的选择性和峰形，然而，由于它们缺乏挥发性，因此在方案中不受青睐，这禁止使用MS检测进行峰鉴定。TFA是一种常用的添加剂，因为它是一种很好的折衷方案，即它既能提供可接受的色谱性能，又能提供MS性能。它没有被选为方案，因为它被证明掩盖了肽和固定相之间的静电和更微妙的极性相互作用，从而降低了色谱柱表征方案的鉴别能力。由于它还可以不可挽回地改变固定相表面，因此对于该方案来说是不切实际的，因为一旦暴露于TFA，该色谱柱就不能与表征方案中的其他添加剂一起使用[30]。本研究的目的是通过区分肽与固定相表面的相互作用来开发一种简单而稳健的色谱柱表征方案，而不是开发最佳的液相色谱方法。然而，TFA和其他有趣或常用的流动相将在以下研究中进行表征，这可能有助于色谱专家选择最合适的流动相进行方法开发。选择甲酸作为色谱柱表征方案的流动相添加剂的主要理由是它缺乏掩盖细微的相互作用（与TFA相比），从而增强了方案的鉴别能力。其他优点包括易于使用MS检测跟踪峰、挥发性和在正电喷雾电离中缺乏信号抑制。甲酸通常不会用于LC-UV，因为它通常产生的峰形很差，但其优点在于它允许用户了解固定相的更纯净的相互作用。
肽分析多数是在低pH值下进行的，以尽量减少肽与中间pH值下去质子化残留硅醇的相互作用，这可能导致有害的条带展宽和物质电离的导致的过度拖尾。然而，由于中间pH值通过改变固定相和肽的物理化学性质而赋予的替代选择性，因此仍应考虑中间pH值。使用甲酸铵可以获得pH值6.45作为中间pH值。尽管在此pH值下缓冲能力很小，但它与LC-MS兼容。甲酸盐的替代品可能是醋酸铵，然而，有各种证据表明，醋酸盐会令质谱信号产生加合物离子。醋酸铵和甲酸铵的比较表明，其MS中的簇形成程度没有明显差异。当然甲酸盐在一些肽上的灵敏度有所提高（高2倍），因此选用甲酸铵用于表征中间pH值下的固定相。
液相色谱仪器为岛津Nexera X2 UHPLC系统，该系统配备了两个二元泵（LC-30AD）和比例阀、脱气机（DGU-20ASR）、具有冷却功能的自动进样器（SIL-30AC）、柱温箱（CTO-20AC）、二极管阵列检测器（SPD-M30A）和通信总线模块（CBM-20A）。岛津单四极杆质谱仪 （LCMS 2020） 用作辅助检测器。LC配置的梯度延迟体积为342 μL [17]。用于控制液相色谱系统的软件是LabSolutions（5.86版）。
实验分为低pH值和中pH值。低pH流动相的制备方法如下：A1：0.1% v/v甲酸的水溶液和B1：0.1%v/v甲酸的乙腈溶液。使用1000 μL可变移液管分配甲酸，在每次制备流动相时确认准确性。低pH下的梯度如下：40 min内为5–45 %B，在45%B下保持2 min，然后在0.1 min内降至初始条件，并重新平衡12 min（相当于10个色谱柱体积）。中间pH流动相的制备方法为：A2：20 mM甲酸铵水溶液和B2：乙腈和20 mM甲酸铵水溶液（80：20 w/w）。从 200 mM 储备缓冲溶液（天然 pH 6.45）制备溶液。中间pH值下的梯度如下：40 min单阶梯度为5.6–61.9 %B，在61.9%B下保持2 min，然后在0.1 min内回落至初始条件。系统重新平衡 12 分钟（相当于 10 个柱体积）。
在 40◦C 和 0.3 mL/min 流速下进行研究，使用215 nm的波长检测。在正ESI模式下，选择离子监测（SIM）。在同一样品中使用不同浓度，根据 m/z 和峰面积跟踪和标识同分异构体。可编程自动进样器用于在自动进样器内制备肽混合物，从而最大限度地减少样品浪费。这些测试混合物包含两种参考肽，它们覆盖了疏水性范围（即弱保留肽和强保留肽）。每种肽混合物含有5-7个肽（肽列表见表3）。样品储存在自动进样器中，温度为 10◦C。
系统适用性测试SST用的混合物含有水，尿嘧啶（死时间标记物）、苄胺（硅羟基活性和负电荷的变化）、苯磺酸（正电荷的变化）、苯甲醇、咖啡因（氢键的变化）、苯酚（酚相互作用的变化[18]）、甲苯、丁基苯和戊基苯（疏水性的变化）。
05
选择性的定义和统一化
每种肽混合物中包含两种参比定位肽，以监测任何保留时间漂移并使保留时间归一化。归一化可以最大限度地减少与仪器、溶剂、分析人员相关的变化，并消除系统驻留体积（Vd）和色谱柱体积（Vm）的任何影响，从而为整个过程获得更大的稳健性，归一化方程式使用方程式（1）。
方程式（1）
其中 tg 是梯度洗脱中的保留时间，tg Ref 1 是 [Met（O）10]- 肽编号 8a的第一个异构体在梯度洗脱中的保留，tg Ref 2 是 [Ile26，Leu27]- 肽 15在梯度洗脱中的保留（图 1）。这两个肽通常是第一个和最后一个洗脱的化合物，因此产生的tg∗值在0到1之间。
图1 包含保留标记物的混合样品的样例
梯度色谱的选择性（α∗）在各种文献中都有定义[33,34]，其中梯度色谱比等度色谱更复杂，因为洗脱液组成、停留体积、柱死体积和梯度形状的变化都会影响选择性。使用方程（2）中具有最稳健和最直观定义方程的肽评估了各种α∗测量值，其中tg是梯度洗脱中的保留时间，tm和td分别是色谱柱死时间和梯度延迟时间。
α∗产生的结果在很大程度上取决于梯度中的洗脱点，尽管在视觉上具有相似的分离程度。如果目标肽在梯度上保留时间较长，则与保留较少的相似分离能力的一对肽相比，将产生较低的α值，从而表明选择性差异。因此，需要一种替代措施来定义选择性。选择性的更好代表是delta（tg，方程（4）），这是两个峰之间归一化保留时间的差异。Delta 值优于 α，因为它纠正了差异，从而提供相同的选择性，无论梯度中的洗脱点如何。该测量允许在固定相和流动相之间进行直接比较，而不管洗脱点如何，从而更纯粹地表示选择性差异。此外，tg还补偿了梯度延迟时间 （td） 的差异。
根据各种性质，包括外消旋作用、空间相互作用、正电荷或负电荷的增加、氧化引起的变化和疏水性/烷基的变化以及氢键或芳香族特性的变化，总共确定了每个流动相的 33 个 delta 值（表 4）。表4记录了甲酸、TFA和甲酸铵梯度条件下的平均tg（以分钟表示）和平均tg*，以便更好地判断选择性的大或小差异。tg结果前面的标志表示分离的洗脱顺序。使用甲酸在 [Leu26] -肽13和 [Lys26]-肽26之间观察到最大的平均差异，这可能是由于电荷的变化引起。最小的平均差异（即tg*值接近于零）是外消旋探针，这突出了区分这些密切相关的物质的困难。外消旋位置的响应差异也突出了分析外消旋体的问题，其中 [L-Ser5] → [D-Ser5] 和 [L-Ser7] → [D-Ser7]-Bovine GLP-2 （1-15） 分别在残基链的 5 位和 7 位不同，但在甲酸和甲酸铵的 tg*上产生了一些显着差异（肽编号 1、6 和 7）。
表4 Delta 列表及其设计理由
06
色谱柱的作用
6.1. 疏水作用
疏水相互作用是反相色谱中的主要保留机制，可以通过研究具有不同疏水性（例如将亮氨酸变为缬氨酸）和改变固定相的疏水性（例如不同的烷基长度）的探针的影响来评估。
Mant等人推导出了氨基酸在没有“最近邻”效应时的疏水性顺序[27]。因此，没有“最近邻”效应的纯疏水相互作用表明，本研究中的洗脱顺序应为 Val < Tyr < Ile < Leu < Phe < Trp。
即肽 20 < 24 < 21 < 13 < 22 < 23。然而，情况并非如此，如图 7 所示。
图7 用不同类型的色谱柱获得的疏水性的相对保留情况，横轴以上为酸性体系结果，横轴以下为中性体系的结果
一种解释可能是，当前研究中的肽在流动相中缺乏二级结构，但在固定相的疏水性乙腈层中会形成二级结构，导致另一个洗脱顺序。
【编译者补充】
用ACD pH Selector 制作的pH-logD 叠合图，疏水性排序Tyr < Val< Ile = Leu < Phe < Trp
理论对应顺序为肽 24 < 20 < 21 = 13 < 22 < 23
[Leu26]-肽13和[Val26]-肽20仅相差一个甲基，这代表了肽整体疏水性的细微变化，然而，当在一系列C18相（Acquity BEH、HSS和CSHs）上进行比较时，两个探针之间存在显著的选择性差异[图7（A）、（D）和（G）]。这与Mant等人的观点一致，他们也发现与用缬氨酸修饰的肽相比，用亮氨酸修饰的肽的保留率更高[27]。
[Ile26，Ile27]-肽21和[Leu26，Ile27]-肽13仅在侧链上亚甲基的位置不同，但是，它们在梯度洗脱过程中对C18相的选择性存在很大差异。文献表明，预计这两种肽之间的保留差异是合理的，因为异亮氨酸上的侧链更靠近肽骨架，因此与固定相相互作用的能力较差[27]。这再次与之前的研究一致，其中用亮氨酸修饰的肽比用异亮氨酸修饰的肽具有更大的保留性。
[Ile26，Leu27]-肽15 具有与 [Leu26，Ile27]-肽13相同的整体疏水性，但在梯度洗脱过程中对 C18 相具有显着的选择性差异（图 7 和 8），这表明存在替代机制。一种可能的解释是，甲基位置的变化改变了固定相疏水性乙腈层中肽的形状，并导致可能发生的相互作用的差异[41-43]。
图8 肽13和肽15在BEH C8色谱柱上有明显的分离，甲酸盐中性流动相
将疏水性更强的分子 [Phe26]-肽22、[Trp26]-肽23 和 [Tyr26]-肽与 [Leu26]-肽 13 进行比较。根据 Mant 等人获得的保留数据，它们具有更大的芳香侧链，疏水性保留机制应 [Phe26]- 肽22和 [Trp26]-肽23保留强 而不是 [Leu26]-肽13（图 7）。[Tyr26]-肽24应该是所描述的四种肽中保留最弱的。然而，在所有 C18 相上，[Phe26]- 肽22、[Trp26]- 肽23 和 [Tyr26]-肽24 都较早洗脱，这证实了疏水保留机制必须与替代机制结合使用。
在Acquity BEH烷基系列固定相上也出现了同样的现象，其中观察到缺乏纯疏水机理[图7（A）、（B）和（C）]。然而，Acquity BEH C8和C4的洗脱顺序发生了细微的变化，其中[Ile26]-和[Phe26]-（肽21和22）的洗脱顺序发生了变化。一种可能的解释是，芳香族基团改变了吸附的乙腈层中肽的形状，从而暴露了其他可以参与极性/静电相互作用的基团[41-43]。
固定相间存在细微的选择性差异，然而，在很大程度上，配体（C4-C18）的类型和长度似乎对这些探针的分离并不重要。
6.2. 电荷作用
[L-Asp11]- 肽9和 [Asn11]-肽1评估负电荷的添加带来的保留变化。比较它们在具有负电和正电特征的固定相上的保留（图9）。
图9 比较不同色谱柱的电荷相互作用，酸性和中性体系分别居于横轴的上方和下方
其中在甲酸流动相中，两组10根色谱柱在天冬氨酸肽9之前洗脱了天冬酰胺肽1。然而，在中性的甲酸铵中，洗脱顺序颠倒，天冬氨酸首先洗脱。
在中间pH值（pH 6.45）下，天冬氨酸肽的净电荷为-4.7，而天冬酰胺肽的净电荷为-3.7，相差为1，因此，由于静电相互作用增强，[L-Asp11]-肽9应当在具有正电荷的色谱柱上最后洗脱。然而，酸性更强的物质[L-Asp11]-肽9首先洗脱，这表明尽管负电荷比[Asn11]-更大，但重要的是电荷的位置和可及性在吸附的肽二级结构中，而不是肽的总净电荷，因此带电荷/亲水性更高的[L-Asp11]-肽9首先洗脱。
然后使用探针 [Lys26]-肽26 和 [Leu26]-肽13研究正电荷的添加。[Lys26]-肽26首先在所有固定相和流动相上洗脱，然而，由于静电相互作用的增加，在甲酸铵条件下的保留性增加。这种差异对于包含羧酸官能团的 Acclaim 混合模式 WCX 最为明显。在 pH 值为 6.45 时，羧酸被去质子化，因此带正电的 [Lys26]-肽26 被强烈保留。由于排斥作用，具有正电荷的色谱柱（CSH系列和Polaris Amide C18色谱柱）在低pH值下比具有负电荷的色谱柱（即更容易接近的硅醇基团）更早洗脱[Lys26]-肽26。
这些相互作用通过图四bi-plot固定相的位置和delta值得到证实。
6.3. 氢键作用
[L-Asp11]- 肽9和 [Asn11]-肽1评估负电荷的添加。比较它们在具有负电性和正电性特征的固定相上的保留（图9）。其中在甲酸中，两组色谱柱在[L-Asp11]- 肽9之前洗脱了[Asn11]-肽1。然而，在中性甲酸铵流动相体系中，洗脱顺序颠倒，天冬氨酸肽9首先洗脱。在中间pH值（pH 6.45）下，天冬氨酸肽9的净电荷为-4.7，而天冬酰胺肽肽1的净电荷为-3.7，因此，由于静电相互作用增强，[L-Asp11]-肽9有望在具有正特性的相上最后洗脱。然而，由于酸性更强的[L-Asp11]-肽9首先洗脱，这表明尽管负电荷比[Asn11]-肽1更大，但重要的是电荷的位置和可及性在吸附的肽二级结构中，而不是肽的总净电荷，因此带电荷/亲水性更高的[L-Asp11]-肽9首先洗脱。
然后使用探针 [Lys26]-肽26 和 [Leu26]-肽13研究正电荷的添加。[Lys26]-肽26首先在所有固定相和流动相上洗脱，然而，由于静电相互作用的增加，在甲酸铵条件下的保留性增加。这种差异对于包含羧酸官能团的 Acclaim 混合模式 WCX 最为明显。在 pH 值为 6.45 时，羧酸被去质子化，因此带正电的 [Lys26]-肽26 被强烈保留。由于排斥作用，具有正性状的色谱柱（CSH系列和Polaris Amide C18色谱柱）在低pH值下比具有负电性的色谱柱（即更容易接近的硅醇基团）更早洗脱[Lys26]。
这些相互作用通过（图4）biplot中固定相的位置和delta值得到证实。
6.4. 芳香基团作用
将含苯基（Acquity CSH 苯基己基、Fortis Diphenyl 和 Ascentis 联苯）和五氟苯基（Acquity CSH Fluoro Phenyl）与 Acquity BEH C18 和 CSH C18 进行比较，评估潜在的芳香相互作用。使用的探针是 [Leu26]-肽13、[Phe26]- 肽22、[Trp26]- 肽23 和 [Tyr26]- 肽24。CSH色谱柱在甲酸和甲酸铵中都具有相同的洗脱顺序，这表明固定相配体对这些分离变得不那么重要（图10）。
图10 比较各种色谱柱的芳香性相互作用
另一方面，二苯基和联苯柱能够分离芳香族物质，并且与CSHs类色谱柱相比，洗脱顺序也不同。[Phe26]-肽22在[Leu26]-肽13之后洗脱，并且[Phe26]- 肽22在中等pH值下保留明显更大，这表明这是由于静电相互作用而不是由于-相互作用。如PCA所示，二苯基和联苯相由于可接近的硅醇基团而显示出负电的特征，而CSH相由于固定相中的带正电荷的基团而具有正电的特征（图4 bi-plot）。
流动相中的乙腈有可能由于竞争性相互作用而减少肽与固定相的任何微弱的芳香族相互作用。仅基于疏水性的洗脱顺序 [Tyr26]- 肽24首先洗脱，然后是[Leu26]-肽13，[Phe26]-肽22，最后是[Trp26]-肽23[27]。然而，本实验情况并非如此，[Trp26]-肽23通常在 [Phe26]-肽22 和 [Leu26]-肽13之前洗脱。这表明存在替代的保留机制，例如在固定相中形成肽的二级结构，暴露某些官能团同时隐藏其他官能团。
6.5. 与肽降解相关的相互作用
开发肽纯度方法需能够分离降解产物。因此，需要评估常见降解物和外消旋产物的选择性。外消旋和异构体产物通常难以分离，因为这些肽是具有非常相似理化性质的非对映异构体。对外消旋体的D型和L型保留顺序的研究表明，在低pH值和中pH值下，保留顺序通常相同。在当前研究中，117 个Delta值和色谱柱组合中有 78% 就是这种情况。比较哪种pH值通常为外消旋体产生较高的Delta值，没有显示出任何趋势。在54%的案例中，中等pH值给出了更大的delta值。Asp / isoAsp 异构体 Delta 值也获得了类似的结果，其中 26 种组合中有 73% 在低 pH 值和中 pH 值下通常给出相同的洗脱顺序。然而，有一种趋势是，低pH值会产生较大的delta值（85%的组合）。
Bi-plot（图4）用于识别固定相的相似度，评估它们分离外消旋体的能力。选择Acquity CSH苯基己基和Acquity HSS C18-SB作为选择性差异较大的固定相，分离[D-Ser16]-肽14和[L-Ser16]-肽13，而Acquity HSS T3和Acquity BEH C18则作为具有相似选择性，并且在Bi-plot中（图 4），两个色谱柱甚为接近。
图11 外消旋体的分离
甲酸体系下的不同色谱柱（图11（A）和（B））在分离度上存在差异，在Acquity HSS C18-SB上存在共洗脱但洗脱顺序切换，而在Acquity CSH苯基己基上则实现了分离。通过改用甲酸铵[图11（E）和（F）]，Acquity CSH苯基己基可实现基线分离，而Acquity HSS C18-SB的洗脱顺序已切换。对于分离外消旋物质等困难的分离，必须具有较大的峰容量。
而离子强度低的溶剂，如甲酸，由于峰形差，通常无法分离这两种物质。有关峰形不佳的解释，请参见第 8 节。在图中。11（C）、（D）、（G）和（H）、Acquity HSS T3和Acquity BEH C18均产生外观相似的色谱图，无论固定相还是流动相如何，都具有相似的选择性和归一化保留时间。
这种比较表明该方法可以显示固定相之间的差异，即使对于具有挑战性的分离，例如分离外消旋物种。上面的示例是使用 Δ（14,13） 选择的。为了从Bi-plot（图4）中选择可能对任何外消旋体的选择性存在较大差异的色谱柱，选择的色谱柱应为Acquity BEH C8、Acquity HSS C18-SB、Acquity CSH氟苯基、Acquity CSH苯基己基和Polaris Amide C18 对[Met（O）10]-肽8和[Met10]-肽1的保留进行比较，以研究氧化的影响。无论流动相条件如何，亲水性更强的氧化蛋氨酸首先在所有固定相上洗脱，在甲酸或甲酸铵梯度条件下，两种物质之间实现了充分的分离。
07
主成分分析
数据矩阵中产生了大量信息，因此使用化学计量工具主成分分析（PCA）将变量数量（即delta值）减少到两个主成分，从而可视化数据中的趋势[9,36]。Delta值是根据感兴趣的交互作用进行编码（表4）。
图2 所有 66 个增量值的（Δ）加载图，显示不同增量值对两个主成分的贡献程度
彼此靠近的增量Delta值对于区分对象（例如色谱柱）具有相似性。色谱柱56% 的变异可使用两个主成分进行描述。使用第三个主成分仅使所描述的变异增加了 11%，且没有提供任何额外的信息，因此只使用了两个主成分。
图3 使用66个Delta值来区分色谱柱
相应的Score Plot图（图 3）显示了色谱柱之间的相似度或者说差异度。彼此靠近的色谱柱更相似，彼此远离的差异度大。图 3 中的色谱柱均基于固定相特性的先验知识进行颜色编码，以对比实际分组情况。绿色圆圈是具有中性特征的色谱柱，配体密度搞和封端完全，其疏水性高且亲硅醇基交互作用程度低。蓝色方块是具有负电特征的色谱柱，例如配体覆盖率低或没有封端，因此具有高度的亲硅醇基相互作用。倒置的红色三角形是具有正电特性的色谱柱，即除了疏水配体外还存在带正电的基团[11]。
尽管所有肽在低pH条件下都具有足够的峰形和性能，但Acclaim混合模式WCX色谱柱被排除在PCA之外，因为混合模式色谱柱上的羧酸部分在pH 6.45下被电离，这导致肽1-12的保留性较差。这些肽可以被认为更具亲水性，在中等pH值下具有-3.7至-4.7之间的电荷。在这些色谱条件下，受影响的肽洗脱过早，这会严重扭曲score plot和loading plot图，因此决定排除 Acclaim 混合模式 WCX 进行比较。仅根据所有14根色谱柱的甲酸数据创建了一个bi-plot图，Acclaim混合模式WCX与负电特征色谱柱分为一组，并且与Acquity CSH氟苯基色谱柱的点相距甚远，因此会对负电性的目标物有特别的选择性。
通过执行迭代研究来评估减少肽RPC色谱柱表征方案所需的增量值数量的可能性，该研究删除了加载图中原点附近的变量（即被认为是一个不重要的变量），或删除具有相似含义的变量，同时确保保持评分图的完整性（即保持色谱柱的相对位置）。经过逐步消除过程后，肽RPC色谱柱表征方案中的变量数量从66个减少到11个，同时仍涵盖一系列重要的相互作用。其中六项测量值在甲酸铵中测定，其余五项在甲酸中测量，共使用三种测试混合物（总结于表5）。从相同的测试混合物中计算要测量的 delta 值，以提高程序的稳健性。
表五：最具有代表性能测试反相肽分析方法能力的混标
图4 ：13种色谱柱在肽RPC色谱柱表征方案的Biplot图
RPC色谱柱表征方案肽（Score和loading plot图，图4）突出了观察结果对固定相位置的影响。可以破译静电相互作用区域，其中上象限中具有负特征的色谱柱（例如 Acquity HSS C18-SB 和 Acquity BEH C4）以正电荷 delta 值为主，而下象限中具有正电特征的色谱柱（例如 Polaris Amide C18 和 Acquity CSH 苯基己基）与负电荷 delta 值相关。对于具有中性特征的固定相，还有一个低静电相互作用的中间区域，由于配体密度高和充分的的封端，其硅醇基活性较低。
为了研究TFA掩盖色谱柱和肽之间的某些相互作用的假设，进行了一项研究，其中在水相和有机相中，用0.1%的v/v TFA取代0.1%的v/v甲酸，Delta值减少。使用参考文献[37]中描述的简化且更稳健的方案版本测试了13根色谱柱，该版本使用了11个探针中的8个，以提高方法的可靠性。在图5（A）的甲酸bi-plot图中可以观察到不同的组，其中描述了87%的变异性，其中可以根据对列字符的已知情况合理化列的位置。使用 TFA，不再看到这些不同的分组，并且仅描述了 68% 的变异性，这表明该数据集的结构不太清晰 [图 5（B）]。
图5 使用甲酸和TFA作为流动相Bi-plot存在明显差异
这似乎证实了TFA将掩盖肽-色谱柱相互作用的假设，令色谱柱变得更加相似。固定相（如Acquity HSS C18-SB）无封端且表面覆盖率低，看起来与具有封端和正电荷的色谱柱（如Acquity CSH Fluoro Phenyl和Polaris Amide C18）相似，但显然两者截然不同。因此，为了描述色谱柱的相互作用，重要的是使用甲酸而不是TFA来评估色谱柱。TFA作为添加剂的进一步评估将在后续文章中描述，其中将表征流动相。
05
峰容量
仅具有选择性本身还并不足以产生良好的色谱方法，还需要色谱效率。色谱效率通过梯度洗脱中的峰容量来衡量。峰容量定义为色谱图中可分离的峰总数（R s = 1），通常通过将梯度时间除以平均峰宽来测量。然而，这种测量往往高估了色谱柱的性能，因此使用样品峰容量（PC∗∗）方法（式（5））来确定用于分离所有目标化合物的梯度分数的峰容量[23]。
公式5 峰容量计算公式
其中和是第一个肽和最后一个肽洗脱的保留时间。W(ave)是除非对映异构氧化蛋氨酸探针外所有分离峰的底部平均宽度。在甲酸、甲酸铵和TFA梯度条件下测量PC∗∗的Delta值减少。如PC∗∗值增加所示，通常使用中间pH值来实现更高的性能（表6和图6）。
表6 不同色谱柱在甲酸，TFA以及甲酸铵体系下的峰容量值
图6 不同色谱柱在三种流动相下的峰容量图，环越大表示峰容量越大
甲酸的特性是峰容量能力较差，而TFA通常产生良好的峰值容量值。甲酸的平均性能仍低于TFA和甲酸铵的峰值性能的28%和41%。低pH值下较差的峰形通常归因于与硅醇基的相互作用，然而，随着现代硅胶技术的提高，这些硅球不再具有大量酸性硅醇，也不再成为碱性物种峰形夸张的原因。McCalley等人推测，由于相同电荷的吸附离子之间的相互排斥效应，碱性物质的峰形不佳通常可归因于碱性物质的过载[28,38,39]。当使用低离子强度流动相时，这种效果会进一步增加。McCalley使用带正电荷的肽探针的进一步研究也支持了这一理论，他比较了磷酸盐缓冲液，甲酸和TFA中四种带正电荷的肽的响应。与甲酸相比，磷酸盐缓冲液具有显著更好的峰形和色谱性能，因为离子强度明显更高，减少了相互排斥。与甲酸相比，TFA的峰形也有所改善，然而，在这种情况下，TFA的离子对效应也特显出来，TFA可以通过部分中和肽的净电荷来减少过载，从而消除排斥效应[28]。虽然甲酸可导致峰形不佳，但Acquity CSH系列固定相并非如此，该系列固定相经过专门设计，旨在改善碱性物质的峰形，因为该相表面存在一个小的永久性正电荷特征[40]。Polaris Amide C18也具有正电荷特性，在甲酸中也具有良好的色谱性能。
09结论
本文作者成功开发了一种使用肽作为探针表征固定相的方案。该方案利用低pH值和中pH值的两种梯度流动相系统来覆盖肽和固定相的不同电离程度。这些肽经过合理设计，以系统地改变被认为对保留性和选择性很重要的特性，包括疏水性、芳香性、氢键度、静电相互作用、空间相互作用和重要的降解途径。将肽混合物在具有不同色谱特性的14个色谱柱中，这些固定相分为中性（即配体密度高且端封程度高的色谱柱）、负电性特征（即配体覆盖率降低或不存在端盖的色谱柱）和最后的正电性状色谱柱（即除反相配基外还具有带正电荷的官能团的色谱柱）。
本文计算了一系列 delta 值，这些值涵盖了以上感兴趣的相互作用，以评估选择性差异。使用PCA对数据进行了分析，其中突出显示了类似于所描述的三组的固定相分组。系统地减少了 delta 值和肽的数量，同时确保了评分图的完整性。对数据的进一步评估表明，固定相和肽之间最关键的相互作用本质上是疏水性的，并结合了极性相互作用。
这些结果表明，正是极性相互作用和固定相中吸附肽的二级结构在很大程度上有助于色谱柱之间的选择性和差异。对于具有相似疏水性的肽表现出较大的选择性差异。另一个有趣的观察结果是外消旋物表现出的巨大选择性差异，这些差异仅因其中一个氨基酸的取向而异。
对肽选择性的评估将在后续文章中进一步研究和扩展。将使用对方法的系统更改和引入的实际限制来评估方案的稳健性，以确保方法的完整性。该评估方案还将应用于来自不同色谱柱制造商的更多固定相，以建立一个数据库，用于为肽分离选择合理的固定相，该数据库将通过分析生物活性蛋白质的胰蛋白酶消化物进行验证。此外，数据库的结果将与小分子色谱柱表征数据进行比较，以确定肽探针与传统小分子方案之间的任何相关性。其目的是利用这些肽来表征一系列流动相，这些流动相采用不同的pH值、离子对添加剂、有机改性剂和盐。
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本篇文章为反相色谱肽分离系统研究的
第一部分，本研究共有四个部分，将陆
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